磷脂脂肪酸的测定方法

PLFA分析采用温和碱性甲酯化方法[100]。实验步骤：1）称3g土壤与15ml0.2M甲醇化的KOH混匀，放入离心管中。2）在37°C培养1h，每10min漩涡震荡一次。3）加入3ml1.0M冰醋酸10ml正己烷，分层。4）4800r离心15min。5）取上清移至试管，在氮气下吹干。6）将试管内磷脂脂肪酸溶解于0.5ml1:1甲基叔丁基醚:正己烷，转移到气质联用色谱分析用小管待分析。将处理好的样品用Agilent6890GC/5973MS气质联用仪进行分析，参数设定如下：色谱柱：利用处理后的石英毛细管柱(0.25mm×30m×0.25μm)。样口温度为250°C，不分流进样。采用恒流模式，流速为0.8ml/min，载气为高纯氦气。程序升温：80°C(保持2min)，以50°C/min的速度升至150°C(保持2min)，以2.5°C/min的速度升至195°C(保持3min)，再以2.5°C/min的速度升至240°C(保持5min)。电离方式：EI(70eV)。离子源温度：150ºC。四极杆温度：230ºC。接口温度：280°C。扫描方式：SIM。C14:0是外标物。磷脂脂肪酸含量计算公式PLFA(nmol/g土样)=（PPLFA×S×V）/(POSTD×D×R×W)式中PPLFA和POSTD分别是样品和标准物质的峰值面积，S为外标标准物质的浓度（ngul-1），V为样品的测定体积（ul），R为分取倍数，D为稀释倍数，W为烘干土质量（g）。