吉凯基因RNA干扰技术wuhan

吉凯基因RNA干扰实验技术课程培训2007年11月中国武汉2006年10月2日，瑞典卡罗林斯卡医学院宣布，将2006年诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学家安德鲁·菲尔和克雷格·梅洛，以表彰他们发现了RNA干扰现象。RNA干扰技术简介RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA(doublestrandedRNA，dsRNA)时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)。外源dsRNA进入细胞后产生的小分子干扰RNA（smallinterferingRNA,siRNA）的反义链和多种核酸酶形成了沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)，RISC具有结合和切割mRNA的作用而介导RNA干扰的过程。RNAi具有特异性和高效性。这种技术已经成为研究基因功能的重要工具，并将在病毒病、遗传性疾病和肿瘤病的治疗方面发挥重要作用。What’sRNAi•双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNAinterference，RNAi）。•RNA干扰具有普遍性、高效性、特异性的特点2006年诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学家安德鲁·菲尔和克雷格·梅洛，以表彰他们发现了RNA干扰现象。RNA干扰技术的应用RNA干扰的最大潜能在于它可以在几天内选择性的关闭几乎每一个基因，并且只是关闭特定的基因，因此它比以往任何一项技术都更适合用于：•基因功能研究•药物靶基因筛选•药物靶点验证实验室简介-已有技术平台和基因资源•技术平台：–①高效siRNA化学合成技术平台（2003年）；–②基因作用靶点快速筛选技术平台（2004年）；–③药物作用靶点快速筛选技术平台（2004年）；–④全长基因克隆技术平台（2004年）；–⑤慢病毒、腺病毒、快病毒的构建、包装和纯化技术平台（2005年）；–⑥siRNA文库构建技术平台（2005年）；–⑦病毒的shRNA文库构建技术平台（2005年）；–⑧稳定表达细胞株构建技术平台（2005年）–⑨转基因小鼠平台（2006年）；•基因资源：–有一个由1800个RNA干扰载体；–600个RNA干扰病毒载体；–100多套工具载体；–6000多个真核基因全长CDS表达载体构成的基因文库。实验室简介-承担国家科技部项目•RNA单体生产及RNA固相合成：上海市科学技术委员会(种子资金)（0341H1115）；•RNA干扰药物核心原料产业化关键技术研究：034319222，上海市科学技术委员会(上海市2003年度重大科技攻关项目)；•RNA干扰技术在乙型肝炎治疗中应用的研究：DZ19208，上海市科学技术委员会(上海市2004年度重大科技攻关项目)；•脑胶质瘤增殖侵袭病理机制研究：863目标导向研究项目（2007AA02Z483）；•其他合作项目GENECHEMGENEDATABASE吉凯基因为您提供在RNA干扰技术领域全方位的实验解决方案载体构建shRNA病毒构建Lentivirus化学合成siRNAH1-GFP-H1-RFP-U6-GFP-U6-RFP-U6-GFP-U6-RFP-Pre-designedsiRNAsValidatedsiRNALibrariesCustomsynthesisservice用户使用吉凯产品或服务发表文章（近60篇）•产品成果：作为基因功能研究的专业技术服务公司，吉凯基因为中国生命科学领域的科学家和医药企业提供了诚信和优质的服务。在过去的3年中，中国生物医学领域科学家发表的国际高质量科学论文中，已经有30多篇使用了吉凯基因的产品和服务，代表性文章包括：•KangJ,ShiY,XiangB,QuB,SuW,ZhuM,ZhangM,BaoG,WangF,ZhangX,YangR,FanF,ChenX,PeiG,andMaL.ANuclearFunctionofb-Arrestin1inGPCRSignaling:RegulationofHistoneAcetylationandGeneTranscription.Cell,2005,123:833-847.（影响因子29）•LiY,JiaYC,CuiK,LiN,ZhengZY,WangYZ,andYuanXB.EssentialRoleofTRPCChannelsintheGuidanceofNerveGrowthConesbyBrain-derivedNeurotrophicFactor.Nature,2005,434:894-898.（影响因子29）•JiaY,ZhouJ,TaiY,andWangY.TRPCChannelsPromoteCerebellarGranuleNeuronSurvival,NatureNeuroscience,2007,10:559-567.（影响因子15）•GaoJ,DuanB,WangDG,DengXH,ZhangGY,XuL,andXuTL.CouplingbetweenNMDAReceptorandAcid-SensingIonChannelContributestoIschemicNeuronalDeath.Neuron,2005,48:635–646.（影响因子14）•Zhou,Y.,Wu,H.,Li,S.,Chen,Q.,Cheng,X.,Zheng,J.,Takemori,H.,andXiongZ-Q.(2006).RequirementofTORC1forLate-PhaseLong-TermPotentiationintheHippocampus.PLoSONE,2006,1:e16.•LuoML,ShenXM,ZhangY,WeiF,XuX,CaiY,ZhangX,SunYT,ZhanQM,WuM,andWangMR.AmplificationandOverexpressionofCTTN(EMS1)ContributetotheMetastasisofEsophagealSquamousCellCarcinomabyPromotingCellMigrationandAnoikisResistance.CancerResearch2006,66:11690-11699（影响因子7.6）•TaoY,YanD,YangQ,ZengR,andWangY.LowK+PromotesNF-B/DNABindinginNeuronalApoptosisInducedbyK+Loss.Mol.CellBiol.,2006,26:1038-1050.（影响因子7.1）•WangZH,ShenB,YaoHL,JiaYC,RenJ,FengYJ.andWangYZ.BlockageofIntermediate-Conductance-Ca2+-ActivatedK+ChannelsInhibitsProgressionofHumanEndometrialCancer.Oncogene2007,doi:10.1038/sj.onc.1210308（影响因子6.8）•ZhangY,ZhuW,WangYG,LiuXJ,JiaoL,LiuX,ZhangZH,LuCL,andHeC.InteractionofSH2-BbetawithRETisinvolvedinsignalingofGDNF-inducedneuriteoutgrowth.JCellSci.,2006,119:1666-1676.（影响因子6.5）•WangT,XiaD,LiN,WangC,ChenT,WanT,ChenG,andCaoX.BoneMarrowStromalCell-derivedGrowthInhibitorInhibitsGrowthandMigrationofBreastCancerCellsviaInductionofCellCycleArrestandApoptosisJ.Biol.Chem.,2005,280:4374-4382.（影响因子5.8）Tuschlrules:AAN19TT,NAN19NN,NARN17YNN,NANN17YNNOnlineDesignSoft:Sfold;siDirect;Dharmacon;Ambion;Qiagen,etc.siRNA设计关键要素-siRNA的自由能化学合成的siRNA•特点：–突出端为dN碱基，增加siRNA的RNase降解耐受性–操作简洁–实验在手时间短–结果明确–实验重复性高–可以根据需要设计多种嵌和体•适合于：–靶点筛选–主要关心基因瞬时敲减结果得到实验–作为vectorbasedRNAi结果的对照实验系统•不适合于：–对于转染效率低于50%的细胞，化学合成siRNA不适合用于直接的敲减结果研究，但可以借用其他高效转染细胞进行靶点筛选；–敲减结果的观察需要持续72小时以上的；–敲减的基因蛋白质分子量大于100KD的，或者蛋白表达水平非常高的；•特点：–可以使用GFP，RFP等报告基因检测转染效率；–可以使用抗生素筛选转染和非转染细胞；–一次制备，可以重复使用；–实验在DNA水平操作，对RNasefree环境要求相对宽松；–VectorbasedshRNA可以通过简单的PCR方法转接到病毒载体上；–实验在手时间比较长：长链DNA合成中往往会引入错误碱基；合成的单链由于自身可以形成发夹结构，双链退火要求的条件比较苛刻；发卡结构影响测序结果，导致即便克隆进载体也得不到正确的测序结果。•适合于：–敲减结果的观察需要持续72小时以上，但仍然观察瞬时敲减结果的–转染效率比较低，但可以通过加抗生素筛选转染细胞的实验；•不适合于：–对于代谢水平比较低的细胞，vectorbasedshRNA转染入细胞后，因为转录水平低而导致shRNA不工作；–敲减结果的观察需要持续10天以上的；–最好不用于靶点筛选，特别是在外源基因靶点筛选系统中的筛选；siRNA表达载体不同载体适合不同研究需要•瞬时表达载体适合于较长时间基因抑制作用的研究，不同抗性和不同报告基因，可实现不同基因在同一细胞的协同抑制研究；•可诱导载体利用四黄素类似物开关对目的基因的抑制；•腺病毒载体适合于在不同细胞类型中研究同一基因RNAi结果•反转录病毒载体提供一种可整合的，稳定的基因抑制研究手段•慢病毒载体提供一种可整合的，并且可以感染分裂和非分裂细胞，稳定的基因抑制研究手段。GeneChemRNAi病毒系统慢病毒是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构，但也有不同于逆转录病毒的组份和特性，作为基因治疗载体发展起来，最近已用于转基因动物制备。利用慢病毒构建的shRNA载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，lentivirus－shRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。GeneChemLentivirussystem不同病毒系统比较病毒表达系统腺病毒表达系统（Adenovirus）慢病毒表达系统（Lentivirus）森林脑炎病毒表达系统（SemlikiForestVirus）病毒基因组双链DNA病毒RNA病毒RNA病毒复制自主复制自主复制自主复制是否整合病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表达外源基因病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达外源基因病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表达外源基因感染细胞类型感染分裂和不分裂细胞感染分裂和不分裂细胞感染分裂和非分裂细胞，能特异感染神经元细胞表达丰度高水平表达中水平表达高水平表达表达时间快（1-2天）慢(