第五章-植物离体快速繁殖和脱毒培养

第五章植物离体快速繁殖和脱毒培养第一节离体快速繁殖技术•离体繁殖：利用离体培养技术，将植物的外植体在人工培养基和合适的条件下进行培养，以在短期内获得大量遗传性一致个体的方法。一、植物快速繁殖的主要步骤•1、建立无菌培养体系•2、无菌培养体系的快速增殖•3、诱导生根•4、试管苗的驯化与移植。1、无菌培养体系的建立外植体的选择、灭菌、接种、培养Cytokinineffectonshootdevelopmentfromdifferentexplant（Hairynightshade）JuHJ.Etal.,.,PlantCellTissOrganCul.2011august.online初代培养中的注意事项•1、建立无菌培养物(选择合适的外植体)•2、条件合适(筛选适宜的培养基和培养条件)•3、保证无菌（减少污染）•4、技术过关(操作熟练迅速)•5、减少褐变危害：1、向外扩散致使培养基逐渐变成褐色2、抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡。初代培养中可能出现的问题：外植体褐变及防止细胞里的酚类物质释放多酚氧化酶氧化棕褐色的醌类物质外植体褐变原因1）与植物种类和与基因型有关不同植物与品种之间褐变现象是不同的，有人把此归结为基因型的不同。一般来说植物材料中单宁类和多种羟酚类化合物的含量高，易引起外植体材料的严重褐化。多数木本植物比草本植物易引起褐化，多年生草本植物比一年生草本植物易引起褐化。外植体褐变原因2）与外植体的取材部位和生理状态有关通常幼龄部位产生褐化较轻，随着组织的老龄化含醌类物质增多而褐化加重。一般在春夏季，尤其是春季采取生长旺盛的外植体产生褐化较轻，已木栓化或木质化的枝条和处于休眠状态的芽作为外植体时褐化严重。外植体褐变原因3）与培养基成分有关高的无机盐浓度不适宜的植物生长调节物质（如BA过高）培养基的pH值高。培养基过硬。外植体褐变原因4）培养条件和培养时间不适宜温度过高、光照过强、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速外植体的褐变。材料转移时间过长也会引起材料的褐变，以致全部死亡。外植体褐变的防止选择适宜的外植体及最佳培养基许多成功的经验表明，选择适当的外植体并建立最佳的培养条件是防止外植体褐变最主要的手段。外植体材料应有较强的分生能力，在最适宜的细胞脱分化与再分化的培养条件下，使外植体处于旺盛的生长状态，便可大大减轻褐变。外植体褐变及防止使用加抗氧化剂在培养基中加入抗氧化剂（抗坏血酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和牛血清白蛋白等），或用抗氧化剂进行材料的预处理或预培养，可预防醌类物质的形成。外植体褐变及防止连续转接在无刺黑莓的茎尖培养中，接种后1—2d就转入新鲜培养基；在山月桂树的茎尖培养中，接种12—24h便转入液体培养基，然后继续每天转移1次，连续7天，褐化便得到了完全控制。外植体褐变的防止调整培养基成分和培养条件适宜的无机盐成分、适宜的蔗糖浓度及激素水平。适宜的温度及在黑暗条件下进行培养也可显著减少材料的褐变。如能在初始培养的1—6周内用暗培养，或在弱光（150lx左右）的光强下进行光培养，可抑制酚类物质氧化。外植体褐变及防止4加活性炭1％～0.5％的活性炭对吸附酚类氧化物的效果很明显。在许多热带树木的组织培养中均曾观察到活性炭防止外植体褐变的明显效果。2、培养物的增殖•1）腋芽增殖：•离体条件下腋芽在细胞分裂素作用下形成丛生芽•激素调节：细胞分裂素（BA）、低浓度的生长素•优点：保持物种的遗传稳定性。2、培养物的增殖•2）不定芽增殖•不定芽：离体培养条件下，通过器官发生重新形成的芽•激素：一定量的生长素和细胞分裂素•可能会改变原有的遗传性状。2、培养物的增殖•3）胚状体繁殖（体细胞胚胎发生途径）（P44）•可选用外植体：•诱导培养基：•优点：增殖率高；免去生根途径•应用的限制因素：发生率低；出苗率低；遗传性状不太稳定3、诱导生根•对于上述途径所获得的芽，在大多数情况下均需要转移到生根培养基进行生根诱导发育成完整植株。•生根培养基一般要求降低无机盐的浓度，提高生长素的浓度，还可适当降低蔗糖的浓度。具体应根据植物种类而定。•炼苗（驯化）：移栽前将培养物不开口，移到自然光照下锻炼2-3d，让试管苗接受强光的照射，使其长得壮实起来，然后再开口炼苗1-2d，经受较低湿度的处理，以适应将来自然湿度的条件。4、试管苗驯化移栽——Transplanting驯化:试管苗在移栽之前所进行的逐步锻炼和适应自然生长环境的过程Differentstagesofdirectandcallus-mediatedplantregenerationinC.soloensis(bar=5mm).(A)Therhizomebudsusedasthestartingmaterial.(B)Theinvitrobudselongatingwithinoneweek.(C)Directpropagationofmultipleshootsonthemediumcontaining1.5MTDZfor30d.(D)Theshootbasesectionsthatwereusedforcallusinduction.(E)InductionofcallioncutsurfacesonMSthatwassupplementedwith2.5uMTDZ,2.0MBAand1.2uM2,4-D,aftertwoweeksinthedark.(F)Amassofcallusthathaddevelopedby30daysafterinoculation.(G)GreenshootprimordiaformedonthecallusonMSthatcontained2.5uMTDZ,9.0uMBAand:1.2uMNAAaftertwoweeks.(H)Ashootthatdevelopedafterthreeweeksunderlight.Exvitrogrowthandbloomingoftheregeneratedplants(bar=1cm).(A)Tissue-culturedplantsreadyforacclimatization;(B)1-month-oldregeneratedplantletsundergoingexvitroacclimatizationina50-cellplugtraywithsphagnum:perlite:sand(1:1:1);(C)3-month-oldestablishedplantsinpotsinagreenhouse;(D)6-month-oldplantsbloominginagreenhouse;(E)7-month-oldplantsbloominginthefield;(F)Maturerhizomes(left)andyoungrhizomesformedinthefirstyear(right).蝴蝶兰的组织培养过程蝴蝶兰的组织培养过程二、快繁中应注意的问题•1、遗传稳定性：影响遗传稳定性的因素有（P45）1）外植体的来源：2）继代培养的时间和次数：3）再生植株的发生方式：4）植物生长物质：2、玻璃化及预防植物组培玻璃化苗的叶和嫩梢呈水晶透明或半透明水渍状；整株矮化肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具栅栏组织，仅有海绵组织。玻璃化及预防玻璃化苗中因其体内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和酶活性降低，组织畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很难成活，严重影响组培苗繁殖率的提高。玻璃化及预防一、玻璃现象及其产生原因玻璃化的起因是细胞生长过程中的环境变化。产生玻璃化苗的因素主要有培养基成分（激素浓度、琼脂用量、离子水平）、环境条件（温度、光照时间、通风条件）等。玻璃化及预防1.培养基成分-激素浓度激素浓度增加尤其是细胞分裂素浓度提高(或细胞分裂素与生长素比例高)，易导致玻璃化苗的产生。产生玻璃化苗的细胞分裂素浓度因植物种类的不同而异。细胞分裂素的主要作用是促进芽的分化，打破顶端优势，促进腋芽发生，因而玻璃化苗也表现为茎节较短、分枝较多的特点。使细胞分裂素增多的原因有以下几种：玻璃化及预防1)培养基中一次性加入过多细胞分裂素，比如6—BA、ZT等；2)细胞分裂素与生长素比例失调，细胞分裂素含量远远高于生长素，而使植物过多吸收细胞分裂素，体内激素比例严重失调试管苗无法正常生长，而导致玻璃化；3)在多次继代培养时愈伤组织和试管苗体内累积过量的细胞分裂素。在初级培养相同的培养基，最初的几代玻璃化现象很少，通常是继代次数越多玻璃化苗的比例越大。玻璃化及预防2.培养基成分-琼脂浓度培养基中琼脂浓度低时玻璃化苗比例增加，水浸状严重，苗向上长。随着琼脂浓度的增加，玻璃化苗比例减少，但由于硬化的培养基影响了养分的吸收，试管苗生长减慢，分蘖亦减少。因此，琼脂的浓度一定要适当。玻璃化及预防3.培养基成分-离子水平植物生长需要一定的矿物质营养，如果营养离子之间失去平衡，试管苗生长就会受到影响。植物种类不同，对矿物质的量、离子形态、离子间的比例要求不同。如果培养基中离子种类及其比例不适宜该种植物，玻璃化苗的比例就会增加。玻璃化及预防4.环境条件-温度适宜的温度可以使试管苗生长良好，当温度低时，容易形成玻璃化苗，温度越低玻璃化苗的比例越高。温度高时玻璃化苗减少，且发生的时间较晚。玻璃化及预防5.环境条件-光照时间不同的植物对光照的要求不同，满足植物的光照时间，试管苗才能生长正常。大多数植物在10～12h光照下都能生长良好，光照时数大于15h时，玻璃化苗的比例明显增加。玻璃化及预防6.环境条件-通风条件试管苗生长期间，要求有足够的气体交换，气体交换的好坏取决于生长量、瓶内空间、培养时间和瓶盖种类。玻璃化及预防二、预防措施尽管玻璃化苗的出现已成为不少快速繁殖的中的普遍现象，但目前对某些植物的玻璃化已得到有效控制。玻璃化及预防1.适当控制培养基中无机营养成分大多数植物在MS培养基上生长良好，玻璃化苗的比例较低，主要是由于MS培养基的硝态氮、钙、锌、锰的含量较高的缘故。适当增加培养基中钙、锌、锰、钾、铁、铜、镁的含量，降低氮和氯元素比例，特别是降低铵态氮浓度，提高硝态氮浓度，可减少玻璃化苗的比例。玻璃化及预防2.适当提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度适当提高培养基中蔗糖的含量，可降低培养基中的渗透势，减少外植体从培养基中获得过多的水分。而适当提高培养基中琼脂的含量，尤其在高温季节，可降低培养基的衬质势，造成细胞吸水阻遏，也可降低玻璃化；如将琼脂浓度提高到1.1%时，洋蓟的玻璃化苗完全消失。玻璃化及预防3.适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度细胞分裂素和赤霉素可以促进芽的分化，但是为了防止玻璃化现象，应适当减少其用量，或增加生长素的比例。在继代培养时，要逐步减少细胞分裂素的含量。玻璃化及预防4.增加自然光照，控制光照时间在试验中发现，玻璃苗放在自然光下几天后茎、叶变红，玻璃化逐渐消失。这是因为自然光中的紫外线能促进试管苗成熟，加快木质化。光照时间不宜太长，大多数植物以8～12h为宜；光照度在1000～18001x之间，就此可以满足植物生长的要求。玻璃化及预防5.控制好温度培养温度要适宜植物的正常生长发育。如果培养室的温度过低，应采取增温措施。热击处理，可防治玻璃化的发生。如用40℃热击处理瑞香愈伤组织培养物可完全消除其再生苗的玻璃化，同时还能提高愈伤组织芽的分化频率。玻璃化及预防6.改善培养器皿的气体交换状况如使用棉塞、滤纸片或通气好的封口膜封口。玻璃化及预防7.在培养基中添加其他物质在培养基中加入间苯三酚或根皮苷或其他添加物，可有效地减轻或防治试管苗玻璃化，如用0.5mg/L多效唑或10mg/L的矮壮素可减少重瓣丝石竹试管苗玻璃化的发生。在培养基中加入0.3％的活性炭还可降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃化有良好作用。第二节植物脱毒培养一、概念•利用植物组织培养技术，脱除植物细胞中侵染的病毒，生产健康的繁殖材