铜绿假单胞菌的分类鉴定

铜绿假单胞菌的分离及鉴定组员：张冲郭泽王平铜绿假单胞菌实验目的了解铜绿假单胞菌的微生物学特性掌握微生物实验技术基本原理及操作熟悉铜绿假单胞菌的分离鉴定程序及方法概述铜绿假单胞菌惯称绿脓杆菌，为革兰氏阴性杆菌，属假单胞菌属。它在自然界分布甚广，空气、水、土壤中均有存在，在潮湿处可长期生存，对外环境的抵抗力比其他菌强，抗干燥的能力也强。生物学特性形态：革兰氏阴性杆菌，菌体长短不一；单端单鞭毛；动力阳性；无芽胞。特性：专性需氧；生长温度范围是25℃~42℃，最适生长温度35℃，4℃不生长。生物学特性抗原性:O抗原H抗原粘液抗原R抗原菌毛抗原产生荧光素和水溶性的绿脓素，培养物呈蓝绿色。生物学特性在血平板上形成大而扁平、湿润、有金属光泽、蓝绿色、透明溶血环菌落，有生姜味；在普通平板、血平板、麦康凯平板上可形成5种不同形态的菌落典型型粘液型侏儒型粗糙型大肠菌样型生物学特性菌落呈灰绿色，大小不一,扁平湿润，边缘不规则呈伞状伸展，表面常可见金属光泽。典型型（麦康凯平板）生物学特性产绿脓素琼脂染成黄绿色典型型（普通平板）生物学特性菌落光滑凸起成粘液状粘液型（血平板）粘液型（麦康凯平板）生物学特性菌落中央凸起边缘扁平表面粗糙粗糙型（麦康凯平板）生物学特性菌落圆形凸起似大肠埃希菌菌落大肠型（麦康凯平板）细小，无光泽半透明菌落侏儒型（麦康凯平板）生化特性氧化酶：+葡萄糖的氧化（O/F）：O枸橼酸盐利用：+精氨酸双水解：+明胶液化：+硝酸盐还原：+乙酰胺酶：+吲哚试验：-微生物学检验脓液痰尿液等直接涂片、革兰染色、镜检分离培养（血平板、麦康凯）18-24h35℃可疑菌落（金属光泽、β-溶血、产绿色素、特殊气味）初步鉴定最终鉴定色素鉴定生化反应42℃生长分型（血清学噬菌体）革兰阴性杆菌，氧化酶阳性菌落特征气味绿脓素报告检验程序药敏试验试验材料病料：痰液标本试剂：氧化酶纸片，明胶、革兰染色液、药敏纸片、无菌生理盐水及生化管配套试剂等培养基：普通平板、血平板、麦康凯平板、半固体培养基、非发酵菌微量生化管等其它：显微镜、培养箱、小试管、载玻片、接种针、接种环、酒精灯、火柴、平皿等分离培养标本采集：脓液、浓痰（无菌拭子）痰液标本的前处理加入等量的PH7.6的1%胰酶溶液，放置35℃、90min使痰液均质化。直接涂片，革兰氏染色，镜检分别接种普通平板、血平板和麦康凯平板，培养18—24h，进一步进行鉴定。初步鉴定选出可疑菌落金属光泽、β-溶血、产绿色素、特殊气味等初步鉴定染色镜检：取可疑菌落，进行革兰氏染色、镜检。氧化酶试验：挑取可疑菌落于滤纸片上，滴加一滴新配制的5%二甲基对苯二胺试剂，15-30min内，出现红色至紫红色，为阳性；若不变色，为阴性。绿脓菌素试验：选取可疑菌落2-3个，置于绿脓菌素测定用培养基，于37℃培养24h，加入氯仿、色素后，再加入盐酸，上层稀盐酸液内出现红色为阳性，表示菌落中含有绿脓菌素。初步鉴定最终鉴定明胶液化试验：选取可疑菌落的纯培养物，穿刺接种于明胶培养基内，37℃培养24h，取出后放入冰箱10-30min，如若溶解，即试验呈阳性；如凝固不溶，试验呈阴性。硝酸盐还原试验：选取可疑菌落的纯培养物，接种于硝酸盐培养基，置于37℃培养24h，如若培养基中的小倒管内有气体，试验呈阳性。最终鉴定吲哚试验：选取可疑菌落的纯培养物接种于蛋白胨水，培养8h-24h后，加Kovacs（靛基质）试剂约3mm高，如若在液层界面发生红色，即为阳性反应。42℃生长试验：选取纯被检物，接种于普通琼脂斜面培养基上，于42℃培养4h，铜绿假单胞菌能生长为阳性反应。血清学鉴定血清群鉴定：取洁净玻片，滴加多价O血清于玻片，再接种此菌的纯培养物少许混匀，2min观察凝集现象，鉴定。血清学分型：按血清分型试剂盒操作说明进行操作：将待检测菌在LB琼脂培养基中过夜培养，取少许与30μL阳性血清混合，一分钟观察结果。判定标准：有凝集块出现，且生理盐水空白对照组不凝集者为阳性。药敏试验扩散法（K-B法）选用抗菌药物，对分离的细菌进行敏感性试验：药敏片：庆大霉素、环丙沙星、头孢噻肟、链霉素、恩诺沙星、诺氟沙星、头孢哌酮、青霉素；根据抑菌圈的大小判断病原菌对药物的敏感程度。