尿中马尿酸、甲基马尿酸的高效液相色谱法1原理

中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所编号：NIOHP-S-11第1页/共3页尿中马尿酸、甲基马尿酸的高效液相色谱法1原理尿样在酸性条件下用乙腈提取其中的马尿酸（HA）、甲基马尿酸（MHA），用饱和氯化钠溶液作为分离剂使水与乙腈分层，经C18柱分离，紫外检测器检测，以保留时间定性，峰高或峰面积定量。2仪器2.1高效液相色谱仪，具紫外检测器。2.2离心机，3000r/min。2.3涡旋振荡器。2.4容量瓶，10mL、2mL。2.5具塞离心管，5mL。2.6微量注射器，10μL、100μL。2.7分析天平，感量0.1mg。3试剂3.1盐酸（ρ20=1.19g/mL），分析纯。3.2乙腈（ACN），色谱纯。3.3冰乙酸（ρ20=1.05g/mL），分析纯。3.4氯化钠（NaCl），分析纯。3.5甲醇（CH3OH），色谱纯。3.6盐酸溶液，1+1。3.7马尿酸（HA），色谱纯。3.82-甲基马尿酸（2-MHA），色谱纯。3.93-甲基马尿酸（3-MHA），色谱纯。3.104-甲基马尿酸（4-MHA），色谱纯。3.11HA标准溶液[ρ（HA）=20.0mg/mL]：准确称取0.2000g，用3.5%盐酸-乙腈溶解，定量转移入10mL容量瓶中，用3.5%盐酸-乙腈稀释至刻度。此溶液为20.0mg/mL标准溶液。3.12MHA标准混合溶液[ρ=4.0mg/mL]：分别准确称取0.0400g2-MHA、0.0400g3-MHA、0.0400g4-MHA，用3.5%盐酸-乙腈溶解，定量转移入同一10mL容量瓶中，用3.5%盐酸-乙腈稀释至刻度。此溶液为4.0mg/mLMHA标准混合溶液。4样品的采集、运输和保存按《职业卫生生物监测总则》进行样品采集。采集后的尿液应立即按1%（v/v）的比例加入盐酸后进行保存。样品在4℃条件下有效期为15d。5分析步骤5.1仪器操作参考条件波长：235nm色谱柱：250mm×4.6mm×5μmC18柱温：30℃进样量：3μL流动相：甲醇+0.4%冰乙酸=35+65流速：0.8mL/min中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所编号：NIOHP-S-11第2页/共3页5.2标准曲线的配制和测定取7只2mL容量瓶，按下表1配制标准曲线。表1HA、MHA标准系列溶液配制按仪器操作参考条件进样测定。以保留时间定性，峰面积定量。每个浓度重复测定三次，取峰面积的均值，以HA、MHA各标准系列溶液的峰面积与相应的浓度（μg/mL）计算回归方程。5.3样品处理和测定取1.00mL尿样于具塞离心管中，加0.1mL盐酸溶液、0.3g氯化钠、2.0mL乙腈后摇匀，于涡旋振荡器上振荡5.0min，以5000r/min离心1.0min，取上清液于色谱进样瓶中，用测定标准系列的操作条件测定样品空白和样品溶液，由回归方程计算样品中HA、MHA的浓度（μg/mL）6计算6.1按式（1）计算样品中HA、MHA的浓度：2C1=C------------------------------------------------------------------（1）式中：C－样品中HA、MHA的浓度，μg/mL；C1－由标准曲线计算所得样品溶液中MHA、MHA的浓度，μg/mL。6.2按照肌酐或比重校正方法对样品结果进行校正。7说明7.1HA方法检出限为3.66μg/mL，方法定量下限为12.20μg/mL；方法测定范围为40μg/mL~2000μg/mL；方法精密度范围为1.0%~3.2%；方法加标回收率范围为95.1%~103.7%（尿中HA浓度为400μg/mL~1600μg/mL）。7.22-MHA、3-MHA、4-MHA的方法检出限分别为1.34μg/mL、1.42μg/mL、1.32μg/mL，方法定量下限分别为4.47μg/mL、4.73μg/mL、4.40μg/mL；方法测定范围均为4.0μg/mL~200.0μg/mL；方法精密度范围分别为3.0%~4.8%、2.1%~3.4%、1.4%~4.8%；方法加标回收率范围分别为94.4%~103.9%、92.3%~100.4%、93.3%~97.5%（尿中2-MHA、3-MHA、4-MHA浓度均为4.0μg/mL~200.0μg/mL）。方法最小取样量为1mL。7.3尿液采集后尽快按0.1%（v/v）加入盐酸，于4℃保存至少可稳定15d。广东省职业病防治院吴邦华丘静静张爱华戎伟丰阮小林0123456HA标准溶液，μL0.02.04.010.020.050.0100.0MHA混合标准溶液，μL0.02.04.010.020.050.0100.0定容体积，mL2.02.02.02.02.02.02.0HA浓度，μg/mL0.020.040.0100.0200.0500.01000.02-MHA浓度，μg/mL0.04.08.020.040.0100.0200.03-MHA浓度，μg/mL0.04.08.020.040.0100.0200.04-MHA浓度，μg/mL0.04.08.020.040.0100.0200.0中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所编号：NIOHP-S-11第3页/共3页重庆市职业病防治院冷晓晓龚进张茂林