荧光显微镜的基本原理

高分辨率荧光显微镜的基本原理和操作要求光学显微镜的基本参数•主要技术参数•数值孔径NA荧光显微镜(fluorescencemicroscope)：某些物质经一定波长的光（如紫外光）照射后，物质中的分子被激活，吸收能量后跃迁至激发态；当其从激发态返回到基态时，所吸收的能量除部分转化为热量或用于光化学反应外，其余较大部分则以光能形式辐射出来，由于能量没能全以光的形式辐射出来，故所辐射出的光的波长比激发光的要长，这种波长长于激发光的可见光部就是荧光(fluorescence)。所谓荧光就是某些物质在一定波长光（如紫外光）的照射下、在极短时间内所发出的比照射光波长更长的可见光。Figure9-14MolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008)Themaximumexcitationandemissionwavelengthsofseveralcommonlyusedfluorescentprobesareshowninrelationtothecorrespondingcolorsofthespectrum.荧光显微镜的组成1、光源：一般采用高压汞灯2、滤色系统：由激发滤板和压制滤板组成a、激发滤板：提供一定范围的激发光b、压制滤板：完全阻挡激发光通过，提供相应滤长范围的荧光3、反光镜：一般采用平面反光镜4、聚光镜：用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成5、物镜和目镜Theopticalsystemofafluorescencemicroscope.Afiltersetconsistsoftwobarrierfilters(1and3)andadichroicmirror(beam-splitting2)荧光染料的使用1、吖啶橙：吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙红色荧光。2、溴化乙锭（EB）:染色DNA和RNA。3、荧光素双醋酸酯(FDA)：FAD本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。4、荧光染料Ho33342和罗丹明123:Ho33342能与细胞中DNA进行特异的结合，罗丹明123能与线粒体进行特异的结合。荧光组化实验中应注意的几个问题1、每种荧光染料，均有自己的最适pH值，此时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的pH值的缓冲液中进行。2、一放荧光染色在20。C以下时荧光比较稳定，温度升高常出现温度猝灭。3、在荧光观察中，常因激发光的增强而使样品荧光很快衰竭，造成观察和照相困难。为此最好用能量小的长波长光进行观察，需照相时再适当增强激发光。4、一般荧光染液的浓度在万分之一以下，甚至亿万分之一，也能使标本着色。在一定的限度内，荧光强度可随荧光素的浓度增加而增强，但超过限度，荧光强度反而下降，这是由于荧光分子间的缔合而使自身荧光猝灭所致。注意事项：1暗室内进行，打开汞灯5-10min稳定后再观察。2荧光淬灭(光漂白)：激发光长时间照射会发生荧光减弱或消失，操作时注意及时用挡板阻挡激发光照射标本。3汞灯关闭后需冷却30min后再重新启动（最好不要短时间内反复开关，标本应集中观察。）4载物台前方黄色遮光板：最好不直接用肉眼看激发光，以防短波光中的紫外伤害。5标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。