4-我国血站核酸检测现状及发展-王露楠

我国血站核酸检测现状及发展卫生部临床检验中心王露楠血站实验室测定技术的发展对流免疫电泳试验反向间接血凝试验酶联免疫吸附试验（ELISA）全自动化学发光免疫试验免疫测定+病毒核酸检测抗体（抗原）检测病毒抗原检测病毒核酸检测血液筛查方法的应用检测的窗口期不断缩短抗-HIVHBsAg抗-HCV•HIVp24抗原•HCV抗原•抗原抗体联合检测NAT•HIV-1RNA•HCVRNA•HBVDNA核酸检测方法直接检测病毒的RNA/DNA，大大缩短了检测的窗口期为什么要开展核酸检测--------------------------------------------核酸P24抗体ELISA0234周(感染时间)ab从a到b的时间为窗口期病毒血症抗体无症状急性HIV症状急性感染期感染年血液筛查核酸检测的背景血站实验室质量管理的发展2007前•《血站管理办法》（暂行）（卫生部令第2号1998）•总体上的经验管理•室内质量控制和室间质量评价•ISO9000认证2007-2009•《血站管理办法》（卫生部令第44号）（2005）•《血站质量管理规范》》[卫医发（2006）167号]•《血站实验室质量管理规范》[卫医发（2006）183号•血站每年的督导检查，ISO17025认可2010-•《卫生部办公厅关于开展2010年血站核酸检测试点工作的通知》（卫办医政函[2010]226号）--血站核酸检测试点核酸检测试点单位数及检测量2010年：15家试点单位，64.2万人份，占年献血人次的6.3%。2011年：共21家血站（16个省市自治区）检测166.6万人份占年献血人次的14.7%。2012年：有31家血站（19个省市自治区）共检测256.8万人份，占年献血人次的20.6%。2013年：61家血站（25个省市自治区）共检测411.7万人份，占年献血人次的32.0%。3年7个月累计进行核酸检测899.3万人份。我国核酸检测的进展情况02004006008001000120014002010年2011年2012年2013年64.2166.6256.8411.610301133124712882010-2013年核酸检测进展核酸检测数量（万人份）总检测数量（万人份）亚太地区血液核酸检测经血传播疾病的风险一般人群HBsAg阳性率7.18%我国现有的慢性HBV感染者约9300万人；人口流动增加乙型肝炎的各种治疗药物治疗方法导致HBV变异株和隐匿性乙型肝炎感染者成为血液安全的威胁HCV感染者0.43%估计存活HIV感染者78万少数高危人群献血比例较高上海100%青海西藏天津99.5%山东29.6%北京87.8%辽宁39.8%海南100%吉林56.2%黑龙江湖北21.6%湖南4.4%河南17.3%广西7.3%陕西49.5%宁夏四川21.6%贵州5.8%新疆12.2%云南32.6%西藏核酸检测工作实施方案我们需要的不仅仅是酶免疫检测核酸检测不仅仅是检测策略问题影响核酸检测推进的因素技术问题实验室、设备、试剂、人员《血站核酸检测实验室管理办法》《全国血站核酸检测技术指导意见》技术培训影响核酸检测推进的因素资金问题一次性投入：实验室改造、设备购置2010年《2010年血站核酸检测项目管理方案》，投入1.65亿持续的投入：按照平均检测成本（60元/人份），全年献血1260万人次计算，全国需投入7.6亿元。影响核酸检测推进的因素集中化检测问题2006年即提出集中化检测模式分级财政的问题使得集中化检测难以实现解决措施？分级财政⇒中央财政统一拨款？统一检测，检测费用由财政统一支出？调整血价提得最多的其他问题检测费用集中检测的协调“试点”的含义一个需要改变原来工作流程不同的新的领域一个发现问题解决问题的过程一个取得经验的过程一个求证的过程一个获得最佳流程的过程血站核酸扩增检测国内目前所用的试剂及方法特点上海科华上海浩源中山达安ROCHE（CobasTaqScreenMPXTest）Chiron（Procleix＠UltrioTMAssay）方法实时荧光PCR实时荧光PCR实时荧光PCR多重实时荧光PCRTMA内标有有有有有HBV、HCV、HIV检测模式各指标分管检测一管内多重PCR，但直接检测三项指标。各指标分管检测一管内多重PCR，不能区分是何指标一管内联合检测先不区分，反应性样本再行单个指标检测检测系统的组成HAMILTON混样仪、提取仪、实时荧光PCR仪HAMILTON混样仪、提取仪、实时荧光PCR仪混样仪、提取仪、实时荧光PCR仪HAMILTONMicrolab®STARIVDPipettor混样仪、COBASAmpliPrepInstrument全自动核酸提取仪、COBASTaqManAnalyzer和thePoolingandDataManagement(PDM)SoftwareTECAN混样仪（如混合样本）、TMA检测仪（一管内完成提取、扩增及杂交发光检测）我国血站NAT试点给我们带来了什么？证明了我国血站NAT的必要性初步形成了我国血站NAT及其质量保证（标本采集等、室内质控和室间质评）的模式和方法探索了我国血站NAT人员培训的模式和方法血站对NAT逐步增强了自信实验室人员的质量意识进一步得到了加强展望新的《血站技术操作规程》（卫医政发〔2012〕1号附件）：一遍ELISA，一遍NAT。《全面推进血站核酸检测工作实施方案（2013-2015年）》（卫计生发[2013]22号）：到2015年，血液筛查核酸检测基本覆盖全国。2013年，东部60%（省会70%）、北京上海80%、中部50%、西部30%（省会40%）以上。以后基本是每年增加10%。工作任务之一，是加强质量管理和控制。整体提高血站实验室管理水平。2010年6月-2013年12月血液筛查核酸检测数量仅占同期检测量的19.1%超过80%的血液存在传播HIV/HCV/HBV的风险！实验室检测策略采血前初筛ELISA检测核酸检测样本的进一步验证、确认及献血者随访HBVDNA-HBsAg酶免检测的结果评估酶免检测的不可替代性核酸检测是否存在假阳性或假阴性联检阳性率鉴别阳性率与血清学指标的相关性HBVDNA阳性-多数源于隐匿性感染肝脏有HBVDNA复制且血清中未检测到HBsAg有别于窗口期一般都为HBcAb阳性（50%HBsAb也为阳性）很少一部分为单独HBsAb阳性没有抗体的初期隐匿性感染HBVDNA试剂的状况Ultrio鉴别MPX,v2.0MPX(v1)PI浩源科华HBV10.44IU/ml8.52IU/ml2.4IU/ml3.8IU/ml6.3IU/ml5IU/mlHBVDNA-HBsAg•HBVNAT无疑为血液安全提供了更好地保障•血清学检测和NAT互补，不可互相替代•依然有可能漏检•导致OBI产生是多原因的，情况各不同•造成输血后感染的危险窗口期anti-HBcOBIanti-HBsOBI•疫苗的作用与基因型有关？慎重调整抗原抗体的检测试剂HBsAg漏检，特别是低值或变异株漏检，往往是sAg-eAb-cAb或sAb-cAb血清学模式，这类模式往往HBVDNA含量很低，甚至＜5IU/ml，目前核酸检测水不可能达到100%检出。核酸检测试剂问题60657075808590951001051103638404244464850阳性预期值ct值阳性预期值江西全国青岛21222324252627282923638404244464850阴性预期值ct值阴性预期值江西全国青岛抗HCV与HCVRNA抗HCV酶免单试剂阳性的结果641,482样本总数复检所用试剂结果为阴性复检出现1家或以上试剂阳性确认结果阴性不确定阳性1028204824138635511.60‰0.32‰1.28‰0.22‰0.99‰0.08‰抗HCV阳性HCVRNA阴性0501001502002503003504001.01-5.005.01-8.08.01-2020HCVRNA阳性和阴性的样本的化学发光检测结果S/Co分布RNA阳性总数RNA阴性总数试剂的状况Ultrio鉴别MPX,v2.0MPX(v1)PI浩源科华HCV3.01/ml3.17IU/ml7.1IU/ml11.0IU/ml23.3IU/ml50IU/ml抗HCV与HCVRNA抗HCV漏检：当抗HCV为阳性时，HCVRNA不一定为阳性，而低值抗HCV虽然HCVRNA阳性比例低，但往往这部分样本的HCVRNA含量并不高。核酸检测灵明度高，但仍有可能漏检。关于HIVMSM献血员是各国都面对的问题几乎100%试剂的状况Ultrio鉴别MPX,v2.0MPX(v1)PI浩源科华HIV29cps33cps47.6IU/ml50IU/mlHIV-1M48.3IU/ml49IU/mlHIV-1O***21.3IU/ml89IU/mlHIV-2***65.1IU/ml59.3IU/ml核酸检测试剂问题检测系统检测模式检测下限HBVDNAHCVRNAHIVRNA罗氏混样后检测（即混合后每毫升）3.7IU/ml10.7IU/ml49copies/ml(HIV-1M)1IU=0.49copies浩源混样后检测6.3IU/ml23.3IU/ml47.6IU/ml科华混样后检测5IU/ml50IU/ml50IU/ml诺华Ultrio10.44IU/mL3．01IU/ml29copies/ml1IU=0.65copies鉴别8.52IU/mL3.17IU/ml33copies/ml1IU=0.65copies核酸检测试剂问题HBVDNAConcentration(IU/mL)NumberofReactivesNumberofIndividualTests%Reactives95%LowerConfidenceLimit(one-sided)12.0189189100.0%98.4%5.019419798.5%96.1%4.018218996.3%93.2%3.618619794.4%90.9%1.312920064.5%58.5%0.44719124.6%19.5%核酸检测试剂问题检测灵敏度—概率问题含量低到一定程度重复性差，不同试剂检测结果差异大，不能以一次检测评价试剂