小鼠脾单个核细胞的分离-20141113硕士班

2014-11-13硕士班免疫细胞所有参与免疫应答以及与免疫应答相关的细胞均被称为免疫细胞。包括淋巴细胞、单核-巨噬细胞、DC、各种粒细胞、红细胞、肥大细胞、干细胞。免疫细胞的种类免疫细胞分离方法：1.根据不同免疫细胞表面标志:FACS;MACS2.根据细胞理化性质：1）根据细胞比重差异：自然沉降法;密度梯度离心法;改变细胞密度法2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞对低渗敏感密度梯度离心法原理根据物理学中颗粒沉降原理，不同密度的物质颗粒在其沉降运动中可因其比重的差别而处于不同的分布位置。利用此原理可设计一定比重的液体界面，将外周血中各种不同比重的细胞通过离心沉降而达到使其彼此分离的目的。5人外周血各类细胞的密度各不相同，血浆和血小板的密度较大，约为1.092；单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞，密度约在1.075。利用密度为1.077±0.001g/L的等渗葡聚糖-泛影葡胺（Ficoll-Urografin)分层液（又称Ficoll-Hypaque分层液、淋巴细胞分层液)进行密度梯度离心,可使血液中的各组分按密度不同梯度重新分布聚集。单个核细胞因密度略低于分层液，主要位于分层液和血浆的分届面上，收集此层乳白色细胞，即可获得较高纯度的单个核细胞。密度梯度离心法本次实验亦根据颗粒沉降原理，将不同密度的小鼠脾脏细胞置于淋巴细胞分离液上水平式离心，使单个核细胞在其沉降运动中位于分离液界面上；达到分离小鼠单个核细胞的目的。已知小鼠淋巴细胞和单核细胞的密度约为1.088，而红细胞与粒细胞的密度均大于1.088。因此，用密度为1.088±0.001的淋巴细胞分离液通过密度梯度离心的方法，可从小鼠脾脏细胞中分离得到单个核细胞。密度梯度离心法器材（1）水平式离心机（2）显微镜（3）血球计数板、血盖片（4）一次性试管、滴管（5）擦镜纸、卷筒纸、镊子试剂：（1）小鼠脾脏细胞悬液（2）淋巴细胞分离液（市售，比重：1.088±0.001）（3）生理盐水（4）白细胞稀释液（5）0.4%锥兰生理盐水溶液操作步骤将1ml小鼠脾细胞悬液混匀，用滴管沿盛有2ml淋巴细胞分离液的试管壁轻轻铺于分离液面上↓将该试管置水平式离心机中离心（2000rpm）15min↓用滴管小心地直接插入白色絮状的细胞层（含单个核细胞），吸出界面层细胞，移入另一离心管内↓加入足量生理盐水，用滴管轻轻上下冲洗混匀↓离心（1000rpm）10min↓弃去上清液，将沉淀细胞充分摇匀，加生理盐水，洗涤1次↓离心（1000rpm）10min↓弃去上清液，将沉淀细胞充分摇匀↓用生理盐水将沉淀细胞稀释至0.3ml(约6滴），摇匀↓取细胞悬液一滴加入等量白细胞稀释液于另一试管中充分混匀，用计数板在显微镜下计数，计算出白细胞总数（/ml）稀释的脾细胞悬液分离液1.077稀释的脾细胞悬液单个核细胞1.076-1.090粒细胞1.092红细胞1.093检查细胞活力：取细胞悬液一滴加入等量锥兰溶液于另一试管中充分混匀↓滴一滴细胞悬液于计数板上↓在显微镜下计数50~100个淋巴细胞中着色的死细胞数计算出活细胞百分率（95%）锥兰是细胞活性染料，常用于检测细胞膜的完整性。还常用于细胞是否存活。活细胞不会被染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色。操作注意事项1.注意分离液与脾细胞悬液的比例，一般以1:2~1:3为宜；2.注意离心温度，最适温度为18～20℃。过低细胞丢失，过高细胞失活；分离得到的单个核细胞可暂时保存在10%FCS-RPMI-1640培养液中，在4℃条件下（减低细胞代谢），可保存24小时，取出时不要立刻升温，以免细胞“温度”休克；3.加入脾细胞悬液时应十分小心，注意保护分离液的界面，勿使混淆影响分离效果；4.每个吸取细胞悬液的步骤，均要混匀细胞；5.做细胞活力检查时，锥兰染色后应尽快计数完毕，时间过长则细胞活力可能降低。细胞计数板示意图计数池支持堤正面观侧面观支持堤支持堤计数池（0.1mm缝隙）1mm15计数时需要遵循一定的方向逐格进行，以免重复或遗漏，对压线细胞采用数左不数右，数上不数下的原则1.细胞数量明显增大时可适当加大稀释倍数。2.充池时要一次完成，不能产生满溢、气泡或充池不足的现象。3.大小方格内压线细胞的计数遵循数上不数下、数左不数右的原则，避免多数或漏数。171.红细胞计数时，如果每个中方格之间相差超过20个以上，要重新充池计数。正常数值范围内，两次红细胞计数相差不得超过5%2.白细胞计数时，一般情况下各大方格间的细胞数相差不超过10%3.如微量吸管内壁沾有白细胞稀释液，会使红细胞破坏，故应先做红细胞计数4.稀释液要过滤，试管、计数板均清洁干燥，以免杂质、微粒等被误认为细胞。实验结果记录与分析通过前后两次细胞计数：1.淋巴细胞浓度（个/ml）四个大方格细胞总数2.计算细胞活力（%）活细胞数细胞总数×100%×10×2×103个/ml4