脱落细胞学(细胞病理学)整理-上节(修正版)

细胞病理学(cytopathology)是检验医学的一个分支，是通过检查细胞的形态结构，进行健康和疾病的筛查、诊断和研究，即对无症状个体进行癌前病变的筛检，对有症状或有体征患者进行诊断和鉴别诊断。根据标本采集方法不同，分为脱落细胞学（exfoliativecytology）和细针吸取细胞学(fine-needleaspirationcytology)。基本检验技术一、标本采集1、原则：①正确地选择采集部位：这是细胞学诊断的基础和关键。故要求准确地选择采集部位，应在病变区直接采集细胞。②标本须新鲜：尽快制片，防止细胞腐败或自溶。③避免干扰物混入，如粘液、血液等。④采集方法应简便易行，操作应轻柔，减轻病人痛苦，避免引起严重并发症和肿瘤扩散。2、采集方法：①直接采集法，②自然分泌液采集法，③灌洗法，④摩擦法，⑤针穿抽吸法直接采集法：皮肤、外阴、阴道、阴道穹窿、宫颈、肛管、口腔、鼻腔、鼻咽部及眼结膜等部位可直接用刮片刮取、刷洗、吸管吸取。食管、气管和肺支气管、胃及直肠则可用纤维内镜在病灶处直接刷取细胞制片。（一）自然脱落细胞标本脱落自上皮表面，包括：①咳出：如痰液。②排泄或导尿：如尿液。③挤压：如乳头分泌物等。【主要特点】：①易从病变器官获取标本。②标本内常含大量各种不同来源、不同类型的细胞，亦可含有炎性细胞、巨噬细胞、微生物和外源性污染物。③细胞成分保存较差。④能进行多次标本采集。（二）非自然脱落细胞指通过物理刮擦作用取得的细胞，采集方法包括：①刷取：如气管、子宫颈。②刮取：如乳头、皮肤、子宫颈。③灌洗：用生理盐水溶液冲洗所得液体，如支气管。【主要特点】：①能直接从病变器官表面采样，如子宫颈和支气管。②使用纤维镜能直接从器官内部获取。③能获得上皮细胞下的病变标本。④细胞成分保存良好，但在结果解释时，不能采用与脱落细胞相同的标准。（三）细针穿刺细胞标本通过穿刺吸取或非吸取法，从充满液体的器官或实体性器官中获得细胞标本，如肿瘤、心包膜腔积液、胸膜腔积液、腹膜腔积液和脑脊液等。影像学技术有助于对小而深、移动且难以触摸的病变部位定位。【主要特点】：①通过触摸或导引法，可从体内任何实体器官采集标本。②方法简捷、费用低、创伤小、并发症少、禁忌证少，经皮肤穿刺术无需麻醉。③需借助病理学知识解释结果。④良好的标本采集和制片技术可获得最佳的结果。⑤局限性：对结缔组织、透明变性、血管性病变、大量坏死物、囊性变或出血性病变等，可导致标本采集不足。二、涂片制作【原则】：①标本要新鲜，取材后应尽快制片。②涂片要轻柔，避免挤压防止细胞的损伤。涂片应均匀，薄厚应适度。太薄细胞过少，太厚细胞重叠，均影响阳性检出率。③玻片要清洁光滑无油渍，先用硫酸洗涤液浸泡冲洗，再用75％乙醇浸泡。④涂片须牢固防止脱落。含有蛋白质的标本可直接涂片；而缺乏蛋白质的标本，涂片前应先在玻片上涂一薄层粘附剂，这样可使涂片牢固。常用的粘附剂为蛋白甘油，由甘油和生鸡蛋蛋白等量混合而制成。⑤涂片数量每位病人的标本至少应涂3~5张玻片，防漏诊。涂片后立即在玻片的一端标上编号或姓名。【方式】：①直接涂片是将新鲜标本直接涂在载玻片上。②间接涂片是将各种液体标本（如生理盐水或运送培养基）进行浓缩处理后再涂片，适用于细胞少的标本。若标本中有凝块，宜采用细胞块或传统组织学方法进行处理。渗出液、灌洗液和尿液等标本不易黏附在载玻片上，宜采用蛋白质（如牛血清清蛋白）或离子类（如多聚赖氨酸）黏附剂，增强细胞和载玻片之间黏附力，最大限度的保存标本中所有细胞。【常用方法】：①推片法：适于稀薄的标本，如胸腹水和血液等。离心后取1小滴标本放在玻片偏右侧端，把玻片上的检液用推片作30°夹角轻轻向左推。②涂抹法：适用于稍稠的标本，如鼻咽部标本。用竹棉签在玻片上由玻片中心以顺时针方向向外转圈涂抹或从玻片一端开始平行涂抹，涂布要均匀，不宜重复。③压拉涂片法：适合较粘稠的标本，如痰液标本。将标本夹于交叉的2张玻片之间，分别移动2张玻片，使之重叠，再边压边拉，这样一次可获得2张涂片。④吸管推片法：亦适于胸、腹水标本。用吸管将标本滴于玻片的一端，再将滴管前端平放在标本滴上，平行向另一端均速移动滴管，即可推出均匀的薄膜。三、标本固定固定（fixation）的目的是要保持细胞的自然形态，以防细菌导致腐败和细胞自溶。固定液能破坏细胞内溶酶体酶及凝固和沉淀细胞内蛋白质，使细胞保持自然形态，细胞结构清晰，容易着色。因此，固定愈及时，标本愈新鲜，细胞结构愈清晰，染色效果愈佳。细胞学检查常用固定液有下面3种：①氯仿乙醇固定液：又称卡诺（carnoy）固定液。渗透性强，能溶解红细胞，固定效果好。适用于一般细胞学常规染色。②乙醇乙醚固定液：优点同氯仿乙醇固定液。③95％乙醇固定液：渗透作用稍差，但制备简单，适于大规模防癌普查。【方法】①带湿固定：涂片后标本尚未干燥即行固定的方法称带湿固定。食管拉网、痰液及阴道分泌物涂片等常用。适于巴氏染色或HE染色。该法固定细胞结构清晰，染色鲜艳。②空气干燥固定：涂片后待其自然干燥，再进行固定。常用于较稀薄的标本，如胃冲洗液、尿液等。适用于瑞氏-吉姆萨染色。与湿固定相比，空气干燥固定有使细胞增大的趋势。四、标本浓缩技术（一）、传统技术1、离心法和细胞离心法：①离心法适用于大量液体标本，如浆液性积液、尿液或生理盐水灌洗液等。②细胞离心法适用于少量液体、中等量细胞的标本，是将细胞直接离心到载玻片上，制成单层细胞涂片，但部分物质会被滤纸吸收而损失，不适用于富含黏液或细胞的标本。2、滤膜过滤法：适用于大量液体、少量细胞的标本，是用各种孔径的滤膜，通过施加一定压力使液体标本中细胞过滤到滤膜上，制成涂片。与离心法相比，能最大限度地捕获标本中的细胞。3、细胞块法：适用于大多数悬液标本，是将标本中细胞聚集成团，形成与传统组织块类似的细胞块，可制作细胞块切片，用于特殊染色。制备方法有血浆凝血酶法和琼脂法等。（二）液基细胞学（LBC）技术：是一种半自动或全自动标本处理新技术，是将刷取或灌洗法采集的标本，放在特殊的运送液或保存液中，制成细胞悬液，经过进一步处理，除去血液、蛋白和炎性渗出物，制成分布均匀的薄片。本质是滤膜过滤法实现了自动化。其优点是：①涂片上细胞分布均匀、分布范围小、背景清晰。②标本筛查简便、快速。③能提高诊断灵敏度和特异度。④能显著降低标本的不满意率。⑤能用于原位杂交和免疫细胞化学染色。五、染色方法许多用于组织切片的染色方法也适用于细胞病理学涂片。不同染色技术均适用于妇科或非妇科标本的永久性染色。巴氏染色法适用于湿固定涂片。苏木素和伊红染色法（HE染色法）是组织切片最常用的方法，也是许多细胞病理学实验室常用的染色方法。其他常用染色方法有组织细胞化学染色，如过碘酸Schiff染色、三色染色、Zie-hl-Neelsen染色、Gram染色和Grocott碘化银染色和有助于识别微生物或鉴别肿瘤细胞分化程度的免疫细胞化学染色等。①巴氏染色特点：是细胞具有多色性的染色效果，色彩多样且鲜艳。涂片染色透明性好，细胞质颗粒分明，细胞核结构清晰。如鳞状上皮完全角化细胞胞质呈桔黄色；不完全角化细胞胞质呈粉红色；而角化前细胞胞质呈浅蓝色或浅绿色。适用上皮细胞染色或阴道涂片中观察女性激素水平对上皮细胞的影响。此方法的缺点是染色程序较复杂。②苏木素-伊红染色法（hemotoxylin-eosin，H-E）染色特点：透明度好，细胞核与细胞质对比鲜明，染色效果稳定。细胞质染成淡玖瑰红色，细胞核染成紫蓝色。红细胞染成朱红色。染色步骤简便，适用于痰液涂片。③瑞氏-吉姆萨染色法（Wright-Giemsastaining）特点：细胞核染色质结构和细胞质内颗粒显示较清晰。此方法多用于胸腹水、前列腺、针吸细胞学及血液、骨髓细胞学检查。操作简便。六、细胞病理学诊断【镜检原则】：①阅片前：应该严格核对送检单与涂片，且仔细阅读送检单上填写的所有资料，尤其是有临床主要体征的病人，需详细了解临床的基本情况，且结合细胞的形态特征及临床表现作出准确客观的诊断。②阅片时：责任心要强：要求认真、耐心、细致，严格按规定程序观察涂片进行诊断。初筛涂片原则：显微镜下视野要有一定的重叠，这是初筛涂片的一个非常重要的原则。初筛应以低倍视野为主，首先观察涂片内各种细胞成分，发现特殊异常细胞成分时，再转换高倍镜仔细观察，作出准确诊断。全面的观察：进行涂片初筛时，应该使用推进器从左向右或从上向下，按一定顺序观察整张涂片内每一个视野，最后仔细观察盖片边缘，防止漏检。有效的标记：对具有诊断意义的异常细胞，应该用标记笔在其左右上下方作出标记，或用圆圈标记，这样有利于进行复查、教学和研究。标记的方法应该在实验室内统一。【报告方式】：直接法（directmethod）：多应用于有特异性细胞学特征，且较易确诊的疾病。可以根据细胞学检查，直接提出疾病的诊断，如“肺支气管鳞状细胞癌”。分级法：用分级形式来表示细胞学检查发现的细胞改变，可以真实客观地反映细胞学所见。改良巴氏5级分类法Ⅰ级：涂片内未见到异常细胞（基本正常）。Ⅱ级：涂片内可见异常细胞，但皆为良性。Ⅱa级：见轻度核异质细胞和变形细胞等。Ⅱb级：见中到重度核异质细胞，属于癌前期病变，需要定期复查。Ⅲ级：见可疑癌（恶性）细胞，其形态明显异常，但难以肯定良性或恶性，需要复查。Ⅳ级：见癌细胞，但是不够典型或数量极少，需要进一步证实。Ⅴ级：见癌细胞，其形态典型而且数量较多，如有可能区分出其组织学类型。【质量保证】1、标本采集：只有采集到合格的标本，作出的诊断才是可靠的。各种标本中应该出现有效的细胞成分才能被称为是满意的标本。如痰涂片内，须有一定数量的肯定的肺泡吞噬细胞，如尘细胞，才是真正的深部痰。2、制片过程：①适宜的涂片：涂片应薄厚适当、分布均匀，在显微镜下每个视野内都布满细胞，间隙很少。涂片内的细胞结构必须清晰。②立即固定：标本制备完毕后应立即放入固定液内固定，使细胞形态保存完好，避免细胞退变影响诊断。固定液的浓度应该标准，过低或过高都可造成细胞形态的变化。③标本的染色：巴氏或HE染色，必须带湿固定，使细胞更真实地保持离体前原有的自然形态。巴氏染色最重要的环节是苏木素的染色。巴氏染色特别适合阴道细胞学检查，瑞氏-吉姆萨染色很适合痰液、胸腹水及针吸细胞学检查。评价细胞学诊断准确性和可靠性有助于比较各种不同检验技术的性能。常用统计学指标有灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确度。假阴性结果是由于筛查错误或解释错误造成，说明采样部位是在病变周围或病变前阶段。假阳性结果是某些疾病之间有类似细胞学改变。【形态学判断的基本原则】检验人员需要依据涂片上细胞数量、分布、大小和形态、细胞质和核特征等进行系统性分析才能做出最终结论。（一）细胞数量和类型细胞数量和类型提供了靶组织或器官的重要信息，不仅反映了病变性质，而且与非病变因素有关，如采样方法等。细胞过多表示增殖过程指数增加，代表增生或肿瘤。细胞过少也并非表示无恶性细胞的存在，因为分化差的恶性肿瘤时，细胞常散在脱落，形态类似于正常。因此，足够量的标本是提高结果解释可靠性的重要因素。（二）结构特征在细胞学涂片中常常缺乏细胞结构特征，而采集大量细胞时能显示组织学特征。正常上皮细胞常保持细胞极性和细胞间黏附性。腺上皮细胞多呈规则排列，单层成片，正面观呈“蜂窝状”，侧面观呈“尖板条栅栏状”。增生和良性肿瘤的上皮细胞常保持良好的黏附性，呈特殊的外观，如乳头状、玫瑰花样或桑椹样结构。合胞体样细胞的边界改变和极性紊乱，应考虑肿瘤可能。典型的恶性上皮细胞的极性差，细胞间相互重叠，有时三维状聚集呈球形。癌细胞具有异常黏附性和异常聚集性2个主要特征。正常淋巴细胞、分化差癌细胞的细胞间黏附性差，常呈散在分布，而淋巴瘤细胞则相反，两者很难鉴别。良性基质细胞常呈卵圆形、梭形，细胞间疏松黏附或呈裸核，恶性基质细胞（肉瘤）与良性基质细胞类似，但细胞核和细胞质多异常。（三）细胞核特征----判断良性与恶性细胞的关键正常细胞核体积相对较小，呈圆形或卵圆形，边界光滑，染色质呈细颗粒状。涂片上同一类型细胞之间差别很小，称为单形性。①若核DNA