4第四章-酶的提取与分离纯化-5节过滤与膜分离

酶工程2006-2第四章酶的提取与分离纯化第一节细胞破碎第二节酶的提取第三节沉淀分离第四节离心分离第五节过滤与膜分离第六节层析分离第七节电泳分离第八节萃取分离第九节结晶第十节浓缩与干燥※第五节过滤与膜分离◆过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。◆过滤介质常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等。※◆根据过滤介质的不同,过滤分为：一、非膜过滤1、粗滤2、微滤二、膜过滤（膜分离技术）1、加压膜分离2、电场膜分离3、扩散膜分离※◆根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同，过滤可以分为粗滤微滤超滤反渗透等4大类。※类别截留的颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤2μm酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微滤0.2～2μm细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤20Å～0.2μm病毒、生物大分子等超滤膜反渗透20Å生物小分子、盐、离子反渗透膜一、非膜过滤◆采用高分子膜以外的材料,如滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属等作为过滤介质的分离技术称为非膜过滤。包括粗滤和部分微滤。1、粗滤2、微滤※1、粗滤：◆借助于过滤介质截留悬浮液中直径大于2μm的大颗粒，使固形物与液体分离的技术称为粗滤。通常所说的过滤就是指粗滤而言。◆粗滤主要用于分离酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、培养基残渣及其它大颗粒固形物。※◆粗滤所使用的过滤介质主要有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属等。◆为了加快过滤速度，提高分离效果，经常需要添加助滤剂。常用的助滤剂有硅藻土、活性炭、纸粕等。※◆根据推动力的产生条件不同，过滤有（1）常压过滤，（2）加压过滤，（3）减压过滤等3种。※(1)常压过滤:以液位差为推动力的过滤。◆实验室常用的滤纸过滤以及生产中使用的吊篮或吊袋过滤都属于常压过滤。※(2)加压过滤:以压力泵或压缩空气产生的压力为推动力。◆生产中常用各式压滤机进行加压过滤。◆添加助滤剂、降低悬浮液粘度、适当提高温度等措施，均有利于加快过滤速度和提高分离效果。※加压过滤用压力泵或压缩空气作过滤动力。★(3)减压过滤:又称为真空过滤或抽滤，是通过在过滤介质的下方抽真空的方法，以增加过滤介质上下方之间的压力差，推动液体通过过滤介质，而把大颗粒截留的过滤方法◆实验室常用的抽滤瓶和生产中使用的各种真空抽滤机均属于此类。◆减压过滤需要配备有抽真空系统。由于压力差最高不超过0.1MPa，多用于粘性不大的物料的过滤。※减压过滤示意图2、微滤:◆微滤又称为微孔过滤。微滤介质截留的物质颗粒直径为0.2～2μm，主要用于细菌、灰尘等光学显微镜可以看到的物质颗粒的分离。◆非膜微滤一般采用微孔陶瓷、烧结金属等作为过滤介质。也可采用微滤膜为过滤介质进行膜分离。※二、膜分离技术◆借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。◆膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。※◆根据物质颗粒或分子通过薄膜的原理和推动力的不同，膜分离可以分为3大类。1、加压膜分离2、电场膜分离3、扩散膜分离※1、加压膜分离:以薄膜两边的流体静压差为推动力的膜分离技术。在静压差的作用下，小于孔径的物质颗粒穿过膜孔，而大于孔径的颗粒被截留。◇根据所截留的物质颗粒的大小不同，加压膜分离可分为微滤、超滤反渗透等3种。※①微滤：以微滤膜（也可以用非膜材料）作为过滤介质的膜分离技术。微滤膜所截留的颗粒直径为0.2～2μm。微滤过程所使用的操作压力一般在0.1MPa以下。◇在实验室和生产中通常利用微滤技术除去细菌等微生物，达到无菌的目的。※②超滤：超滤又称超过滤。是借助于超滤膜将不同大小的物质颗粒或分子分离的技术。超滤膜截留的颗粒直径为20～2000Å。相当于分子质量为1×103～5×105道尔顿（Da）。◇主要用于分离病毒和各种生物大分子。◇膜的透过性一般以流率表示。流率是指每平方厘米的膜每分钟透过的流体的量。超滤时流率一般为0.01～5.0mL/cm2•min。膜的孔径大，流率也大。※超滤装置示意图◇影响流率的主要因素是膜孔径的大小。此外，颗粒的形状与大小，溶液浓度，操作压力，温度和搅拌等条件对超滤流率也有显著影响。◇在酶的超滤分离过程中，压力一般由压缩气体来维持，操作压力一般控制在0.1～0.7MPa。※③反渗透：反渗透膜的孔径小于20Å，被截留的物质分子质量小于1000道尔顿。操作压力为0.7～13MPa。◇主要用于分离各种离子和小分子物质。※2、电场膜分离◆电场膜分离是在半透膜的两侧分别装上正、负电极。在电场作用下，小分子的带电物质或离子向着与其本身所带电荷相反的电极移动，透过半透膜，而达到分离的目的。（1）电渗析（2）离子交换膜电渗析即属于此类。※（1）电渗析：◆渗析时要控制好电压和电流强度，渗析开始的一段时间，由于中心室溶液的的离子浓度较高，电压可低些。当中心室的离子浓度较低时，要适当提高电压。◆电渗析主要用于酶液或其它溶液的脱盐、海水淡化、纯水制备以及其它带电荷小分子的分离。也可以将凝胶电泳后的含有蛋白质或核酸等的凝胶切开，置于中心室，经过电渗析，使带电荷的大分子从凝胶中分离出来。※（2）离子交换膜电渗析：◆离子交换膜电渗析的装置与一般电渗析相同。只是以离子交换膜代替一般的半透膜而组成。◆离子交换膜的选择透过性比一般半透膜强。◆离子交换电渗析在酶液脱盐、海水淡化、以及从发酵液中分离柠檬酸、谷氨酸等带有电荷的小分子发酵产物等。※3、扩散膜分离◆扩散膜分离是利用小分子物质的扩散作用，不断透过半透膜扩散到膜外。而大分子被截留，从而达到分离效果。常见的透析就是属于扩散膜分离。◆透析膜可用动物膜、羊皮纸、火棉胶或赛璐玢等制成。◆透析主要用于酶等生物大分子的分离纯化，从中除去无机盐等小分子物质。※透析：透析(Dialysis)是利用蛋白质不能通过半透膜,使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开,将待提纯的溶液装入半透膜的透析袋中，放入蒸馏水或缓冲液中，小分子物质借扩散进人透析袋外的蒸馏水或缓冲液中。这样通过更换透析袋外液，使透析袋内的小分子物质降至最低。截留约15000Da分子。※超过滤(Ultrafiltration)：是利用压力或离心力强行使溶质按分子量、形状、大小的差异，所需溶质分子阻留在膜的一则，而小分子溶质则随溶剂透过膜压到另一侧，这样使大小溶质分子得到分开。所以它的持点是利用有选择透过的多微孔膜，在液压作用下，分离出大分子溶质（下图）。※超滤装置示意图实验室内常用的超滤装置有以下几种：(1)中空纤维超滤器中空纤维超滤装置是将成束的中空纤维装入一筒内，两端封闭。当轴流通过管腔时，造成高剪切力，在截留溶质分子的同时，将浓度降至最低限度。每根中空纤维内腔直径为0.2mm,中空纤维由惰性的非离子聚合物制成．具有各向异性、抗堵塞性，运用成束纤维表面积大，超滤流量大、阻留溶质的浓度范围(4％一20％左右)如下图。a超滤过程b浓缩透析仪（2）封闭式超滤装置封闭式超滤装置有搅拌和不带搅拌的两种。搅拌型超滤器带有磁力搅拌或机械振动，借助搅拌或振动造成高液流从而控制浓度极性.溶质浓度—般为5%（图ａ）．无搅拌型超滤器也有多种形式，如用惰性气体推动柱塞迫使溶液过滤的叶柱塞推进式加压超滤器(图b)．由于它无搅拌，没有控制浓度极化，而只能处理小体积的溶液,溶质浓度1%.（３）循环型超滤器这种超滤装置浓缩大溶质的浓度可达40％，同时，可用于大溶质的分离。这是—种带有浅道的超滤装置。它使液体在浅道中奔流，从而使其具高剪切力稳定的层流，将浓度极化下降到最低．