蛋白纯化AKTA操作说明

AKTApure操作说明分子筛层析操作步骤：1.开机：打开AKTApure开关，看指示灯，泵同步（泵内有注入液体的声音）。2.打开系统：打开电脑：双击Unicorn7.0打开系统，进入logon界面，用户名默认为Default，输入密码：default，点ok键，出现提示对话框，继续点确定，进入系统。注意：进入系统时会弹出三个界面：SystemControl界面，Evaluation界面和Administration界面。其中systemControl界面为主操作窗口，所有的设置选项都是在该界面下完成：Manual---ExecuteManualinstructions---......；Evaluation界面为结果数据查看及处理窗口；Administration界面为Unicorn7.0系统设置界面。3.洗泵：把A1泵头从20%乙醇中取出，用去离子水冲洗，放入分子筛缓冲液中，在SystemControl界面下，点击manual---ExecuteManualinstructions---Pumps---PumpAwash---点开inlet，选择A1---Excuse。4.设置系统参数：设柱压：Alams---alamsystermpressure---highalam---设置柱压---Execute；设流速：Pumps---Systemflow---设置systemflow（1mL/min）---Execute。注意：流速和柱压设置参照“GE蛋白纯化柱表”，不要超出最高限制。5.装柱子(先上后下)：接柱子的上面：拧下连接进样阀和检测器之间的线，等进样阀出口有液体流出时，拧开柱上面线头的螺帽，将它连到进样阀出口；接柱子的下面：去掉柱下端连接的注射器，连上接头，连上一段线，待液体滴出滴出液体滴到检测器上的连接口的洞里，滴满，将接头连到检测器的连接口里。6.平衡柱子：分子筛buffer平衡柱子，一般要两个小时左右，盐离子浓度达到5.5%左右。7.设置系统及收集参数：命名：先end---Manualinstructions，点击browse，弹出selectresultname&location界面，点开文件夹“defaultHome”，找到文件夹“labdata”，点开，选择自己名字首字母缩写文件夹(已创建)，在界面下方“name”指令框进行命名。注意：命名时要标明日期，柱子型号，样品名称。设流速：Pumps---Systemflow---设流速（1mL/min）---Execute；设柱压：Alams---alamsystermpressure---highalam---设置柱压---点击Execute；洗A泵：Pumps---PumpAwash---点开inlet，选择A1---Excuse；紫外调零：Monitors---AutozeroUV---Execute；设置收集体积：Fractoncollection---peakfractionation---fractionsize---设置收集体积---Execute；一般设为1mL(可根据实际情况调整)。设置收集水平：Fractoncollection---peakfractionationparameters---Startlevel---设置起始收集水平---Execute。注意：对于初次纯化的蛋白，由于蛋白含量未知，起始水平可设低些，如10mAU,避免损失蛋白。8.上样：冲洗Loop环：取5mL注射器，吸取5mL分子筛（不能有气泡），从进样口注射2倍Loop体积的分子筛来清洗Loop环；蛋白样品处理：取出蛋白样品（2mL），12000rpm离心3min，把上清转移至新的离心管管，重复一次，以去除沉淀，避免堵塞系统；手动蛋白上样：把蛋白样品转移至注射器内，从进样口把样品注射入Loop环内；注意：上样时应小心操作，首先弹出注射器内的气泡，随后稍推注射器，使注射器出口处悬挂一样品液滴（别太用力，导致液滴滴落），然后把注射器插入进样口，把蛋白样品推入Loop环中。Inject:点击Flowpath---injectionvalve---点开position选项---inject---Execute---走2倍Loop体积的分子筛缓冲液；Load:点击Flowpath---injectionvalve---点开position选项---manualload---Execute，调回Load状态。9.收集目标蛋白：参照标准蛋白曲线，估计样品出峰位置，收集蛋白样品，做好标记，过完后，peakfracstop900停止收集。10.20%乙醇平衡柱子：等精氨酸峰出来，离子浓度平衡后，点击pause，进分子筛的buffer的泵头用去离子水洗，放入20%的乙醇中，continue---洗泵（A1泵），平衡柱子。20%的乙醇平衡柱子，一般要两小时左右，盐离子浓度达到0%。11.收柱子（先下后上）：调节流速至0.5mL/min，拧下柱下面的接头，连上注射器，再调流速至1mL/min，注射器内吸入3-5mL20%乙醇，取下柱上面的接头看是不是往外流液体，因为注射器内有压力，液体会倒流，盖子内滴满液体，立即拧上盖子，防止进气泡，将进样阀的线接到检测器上。12.关闭系统：点击End关闭系统界面，关闭AKTApure电源，关电脑。2018-09-01AKTApure操作说明离子交换蛋白纯化步骤（RESOURCEQ/S）1.开机：打开AKTApure开关，看指示灯，泵同步（泵内有注入液体的声音）。2.打开系统：打开电脑：双击Unicorn7.0打开系统,进入logon界面，用户名默认为Default,输入密码：default,点ok键，出现提示对话框，继续点确定，进入系统。注意：进入系统时会弹出三个界面：SystemControl界面,Evaluation界面和Administration界面。其中systemControl界面为主操作窗口，所有的设置选项都是在该界面下完成：Manual---ExecuteManualinstructions---......；Evaluation界面为结果数据查看及处理窗口；Administration界面为Unicorn7.0系统设置界面。3.洗泵：点击pause暂停系统---去离子水冲洗A1,B1进液泵头---分别放入A，B液中；洗B泵：选择SystemControl界面manual---ExecuteManualinstructions---Pumps---PumpAwash---点开inlet，选择B1---Excuse；洗A泵：选择SystemControl界面manual---ExecuteManualinstructions---Pumps---PumpAwash---点开inlet,选择A1---Excuse,洗泵结束后调B至100%，0min---Execute。4.设置系统参数：设柱压：Alams---alamsystermpressure---highalam---设置最高柱压---Execute。设流速：Pumps---Systemflow---设置systemflow（1mL/min）---execute；注意：流速和柱压设置参照“GE蛋白纯化柱表”，不要超出最高限制。5.安装RESOURCE柱（先上后下）：装离子柱时先拧开离子柱上面，连上来自进样阀的线，边拧紧上面边拧松柱下面，在离子柱子下端出口连上转接头，接上一根较短的先并连到检测器上（流出液体，滴满检测器上的连接口的洞里，再拧紧）。6.平衡RESOURCE柱：等B液平衡后，点击Pumps---gradient---Target---调B至0%，0min---Execute。等平衡后，记录最高和最低盐离子浓度：离子交换B液盐离子浓度约为84%，离子交换A液盐离子浓度约为1.7%。7.设置系统及收集参数：命名：先end---Manualinstructions，点击browse，弹出selectresultname&location界面，点开文件夹“defaultHome”，找到文件夹“labdata”，点开，选择自己名字首字母缩写文件夹(已创建)，在界面下方“name”指令框进行命名。注意：命名时要标明日期，柱子型号，样品名称。设流速：Pumps---Systemflow---设流速（1mL/min）---Execute;设柱压：Alams---alamsystermpressure---highalam---设置柱压---点击Execute；紫外调零：Monitors---AutozeroUV---Execute；设置收集体积：Fractoncollection---peakfractionation-fractionsize---设置收集体积---Execute；一般设为1mL(可根据实际情况调整)。设置收集水平：Fractoncollection---peakfractionationparameters---Startlevel---设置起始收集水平---Execute。注意：对于初次纯化的蛋白，由于蛋白含量未知，起始水平可设低些，如10mAU，避免损失蛋白。8.上样：冲洗Loop环：取5mL注射器，吸取5mL分子筛（不能有气泡），从进样口注射2倍Loop体积的分子筛来清洗Loop环；蛋白样品处理：取出蛋白样品（2mL），12000rpm离心3min，把上清转移至新的离心管管，重复一次，以去除沉淀，避免堵塞系统；手动蛋白上样：把蛋白样品转移至注射器内，从进样口把样品注射入Loop环内；注意：上样时应小心操作，首先弹出注射器内的气泡，随后稍推注射器，使注射器出口处悬挂一样品液滴（别太用力，导致液滴滴落），然后把注射器插入进样口，把蛋白样品推入Loop环中。Inject:点击Flowpath---injectionvalve---点开position选项---inject---execute---走2倍Loop体积的分子筛缓冲液；Load:等流穿峰出来后，点击Flowpath---injectionvalve---点开position选项---manualload---Execute，调回Load状态。注意：流穿峰蛋白先别丢弃，它有可能是样品没有挂上柱子而直接流出来的目标蛋白。9.洗脱目的蛋白：Pumps---Gradienttarget50%，length50min(可调)---Execute，自离子柱上洗脱结合的蛋白10.收集目标蛋白：收集洗脱下来的蛋白样品，做好标记，过完后，peakfracstop900停止收集。11.B液平衡离子柱：Pumps---Gradienttarget50%，length0min---Execute，至盐离子浓度达到最高且平衡。如继续纯化其他蛋白样品：要用A液再平衡后再上样，步骤同上1-11。如不再纯化其他蛋白样品：点击pause暂停系统---去离子水冲洗A1,B1进液泵头，放入20%的乙醇中，洗A泵，洗B泵，洗完后，调Btarget0%，length0min---Execute，至盐离子浓度为0%.12.收RESOURCE柱（先下后上）：收离子柱时，设流速为0.5mL/min，先拧下离子柱下端，并用螺母接头封闭离子柱下端接口，封闭柱下面接口的同时松柱上面的接头，拧上柱上面的螺母封闭柱上端接口，随后将进样阀的线接到检测器上。13.关闭系统：点击End关闭系统界面，关闭AKTApure电源，关电脑。