Lorry法测定蛋白浓度

Lowry法测定蛋白质浓度本法用于微量蛋白质的含量测定。蛋白质在碱性溶液中可形成铜—蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。试剂（1）酚试剂市售酚试剂在使用前用0.5mol/LNaOH滴定液，以酚酞为指示剂，根据试剂酸度将其稀释，使最后酸度为1N。（2）碱性铜溶液取0.1mol/L酒石酸钾溶液与0.04mol/L硫酸铜溶液(CuSO4·5H2O)溶液各0.5mL，4％碳酸钠(Na2CO3)溶液与0.8%NaOH溶液各25mL，摇匀，即得（注：现用现配）。（3）0.5mol/LNaOH滴定液的配制及标定取NaOH适量，加水搅拌使溶液成饱和溶液，冷却后，置聚乙烯塑料瓶中，静置数日，澄清后，取澄清的NaOH饱和溶液28mL，加新煮沸后冷却的水，使成1000mL，摇匀。取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约3g，精密称定，加新煮过的冷水50mL,摇匀，使其尽量溶解；加酚酞指示剂2滴，用本液滴定；在接近终点时，应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解，滴定至溶液显粉红色。每1mLNaOH滴定液相当于102.1mg的邻苯二甲酸氢钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量，算出本液的浓度。（4）标准蛋白质溶液的制备取人血白蛋白标准品1支，用水定量稀释至每1mL含1mg,作为贮备液。精密量取贮备液2.5mL至25mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即为每1mL含100μg的标准蛋白质溶液。测定方法精密量取一定体积供试品（含蛋白质50μg左右）置试管内，加水至1mL，加碱性铜溶液5mL，摇匀，室温放置10min，快速加入酚试剂0.5mL,摇匀，室温放置30min，显色后，照紫外—可见光光度法，在波长650nm处测定吸光度（显色后，如发现混浊，3000r/min，离心15min，取上清液测定）。精密量取标准蛋白质溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL分别置于试管中，加水至1mL，加碱性铜溶液5mL，摇匀，室温放置10min，快速加入酚试剂0.5mL,摇匀，室温放置30min，显色后，照紫外—可见光光度法，在波长650nm处测定吸光度（显色后，如发现混浊，3000r/min，离心15min，取上清液测定）。准确量取1mL水作空白对照，具体操作方法同上。以标准曲线的蛋白质浓度对应其吸光度，取直线回归方程，将测定供试品的吸光度代人直线回归方程，即得供试品的蛋白质含量。