DNA计算中荧光技术的应用及其发展计算中荧光技术的应用及其

《计算机学报》2009年12期，2009，32（12）DNADNADNADNA计算中荧光技术的应用及其发展计算中荧光技术的应用及其发展计算中荧光技术的应用及其发展计算中荧光技术的应用及其发展张成杨静王淑栋(北京大学信息科学技术学院，高可信度软件技术教育部重点实验室，北京100871)摘要摘要摘要摘要：：：：DNA计算作为前沿科学研究的重点和热点，已经从简单发展为复杂，从理论转化为应用。在这一过程中，反应速度快，变化灵敏的荧光标记技术发挥了重要的作用。本文围绕DNA计算和荧光标记技术两个方面进行说明。一方面，对近年来DNA计算中荧光技术的应用进行了总结：（1）荧光标记的表面计算。（2）与某些酶切技术相结合的荧光检测。（3）与DNA链置换相结合的荧光技术。（4）与基因沉默技术相结合的荧光DNA逻辑门。（5）与DNA自组装立体结构相结合的荧光技术。（6）与DNA变构相结合的荧光技术。另一方面，介绍了几种近年来发展起来的新型荧光技术：（1）荧光信号识别放大技术。（2）与磁珠技术相结合的荧光技术。（3）与PH值变化相结合的DNA荧光技术。（4）与miRNAs检测相结合的荧光技术。在今后的研究中，只有将这两者紧密结合，才能发挥DNA计算天然的优势。关键词关键词关键词关键词：：：：DNA计算；荧光标记技术；纳米技术；DNA分子；杂交1引言引言引言引言DNA由于其具有的特性，在大自然的进化中，被选择为稳定的遗传物质。在细胞中，DNA精细地编码并控制着整个细胞的新陈代谢。另一方面，DNA分子容易构成二级甚至三级结构。因此，DNA作为计算工具有着得天独厚的优势1,2。近年来，DNA计算领域发展迅速，尤其在DNA分子自组装、DNA纳米装置等方面3。然而伴随着DNA计算解决问题的规模增大和形式多样化，求解过程中DNA分子数量急剧增加以及DNA分子结构复杂性的加大，求解过程中实验过程繁琐且存在误差，使得DNA计算中解的标记和检测变得更加困难4。为了解决这一难题，荧光技术在DNA计算中逐渐得到了广泛的应用。荧光是指某些物质受到某种波长的光激发后，其原子中的电子被激发到较高能级，产生的发射光。荧光物质分子都具有刚性结构和共平面的π-π共轭体系。在激发态时，这种结构具有稳定性，可以持续数秒钟，从而有利于能量的转移5。DNA荧光技术在生物学领域中已经有很多应用，如近年来发展起来的DNA荧光标记、real-time检测技术、分子信标技术等。荧光标记DNA简单便捷，可以实时检测，而且灵敏度非常高，这些特点都使得其在DNA计算中具有广泛的应用前景。目前，结合荧光技术的DNA计算已经成为前沿研究热点。荧光技术在DNA计算中的应用主要有如下几类：（1）荧光标记的表面计算：通过DNA固定化和杂交技术，在固相表面通过荧光标记进行计算。（2）与某些酶切技术相结合的荧光检测：利用特定酶与DNA分子的特性，通过检测酶切后荧光量进行计算。（3）与DNA链置换相结合的荧光技术：巧妙利用DNA分子的三链甚至多链结构，通过加入引发链，来释放另一DNA链。（4）与基因沉默技术相结合的荧光DNA逻辑门：利用RNAi技术控制表达荧光蛋白，从而构建了多重逻辑门。（5）与DNA自组装立体结构相结合的荧光技术：在DNA自组装结构的基础上，结合了荧光标记技术。（6）与DNA变构相结合的荧光技术：通过DNA分子的不同状态，构建了可控的荧光纳米装置。近年来，荧光技术不仅应用于生物学本身，而且在DNA计算、信息学等诸多领域具有很大的应用潜力。下面有几种近年来发展起来的新型荧光技术：（1）荧光信号识别放大技术。（2）与磁珠技术相结合的荧光技术。（3）与PH值变化相结合的DNA荧光技术。（4）与miRNAs检测相结合的荧光技术。相信随着DNA计算和荧光技术的发展，这两者必将紧密《计算机学报》2009年12期，2009，32（12）结合，使得DNA计算的种类和方法更加多样和成熟。2DNA计算中荧光技术的应用计算中荧光技术的应用计算中荧光技术的应用计算中荧光技术的应用2.1荧光标记的表面计算荧光标记的表面计算荧光标记的表面计算荧光标记的表面计算DNA表面计算其基本原理是：通过DNA固定化和杂交技术，将代表所有可能存在解的不同DNA序列固定在固相表面，然后通过多次的杂交以及降解过程来筛选正解。通过荧光标记可以检测每次和最终计算的结果。2002年，Adleman组使用杂交池完成了一个20个变量的3可满足性问题6。2004年XingPingSu等在2000年Liu7的工作基础上，设计了一种通用型的DNA表面计算模型8。同年，KristianeA.Schmidt等利用单分子杂交荧光标记技术4个变量的可满足性问题9。下面以2000年，Liu等发表在nature上的DNA表面计算经典实验为例，说明其解决SAT问题的过程7。由于该问题共有16种可能性，故将代表着不同可能解的DNA片段固定在固相表面。在每一次的杂交筛选过程中，加入与固定DNA链特异性互补的DNA。那末，被杂交的固定DNA链变为双链，而未互补的单链DNA则被核酸外切酶Ⅰ降解。通过数次操作，存在于固相表面的DNA链就是每次经杂交而保留下来的DNA链，也就是代表正解的DNA链。该实验中，荧光技术主要应用在解检测的过程中：使用一条生物素标记的引物和另一条荧光标记的引物，以固相表面所有可能解的DNA片段为模版，进行PCR。利用磁珠将PCR双链产物吸附，再分离双链，分离出荧光标记的ssDNA。将这些ssDNA与经过多次杂交筛选的固相杂交，只有哪些存留在固相表面的DNA链可以杂交上，于是特定的位置就可以检测到较高荧光强度。图1-1实验示意图图1-2列阵荧光检测结果2.2与与与与某些某些某些某些酶切技术相结合的荧光检测酶切技术相结合的荧光检测酶切技术相结合的荧光检测酶切技术相结合的荧光检测利用酶与DNA分子的特性，通过检测酶切后荧光量进行计算。其实就是利用某些酶与DNA分子空间结构的相互作用，再结合荧光技术来共同实现的。这种方法具有灵敏度高，反应速度快等特点。其最大的优点就是巧妙地将酶的生物特性与计算问题相结合，极大地丰富了DNA计算的手段。2001年，Wang等在上述表面计算实验的基础上对解的检测又进行了新的改进，即将酶切和荧光技术相结合10。通过上述核酸外切酶的方法，利用新技术完成单链DNA的解的检测。其基本思想如下：左侧DNA探针的3’端至少和右侧杂交的DNA探针有一个碱基的重合，并使得右侧探针有5’端呈单链状态。此时右侧探针由两部分组成：一部分是和目标序列形成双链的；另一部分则是由非互补的5’端DNA链组成（见图2A）。此时该非互补的5’端DNA臂会覆盖在上游寡核苷酸链上，与左侧探针至少有一个重合的碱基。恰恰在这重合的位置，可以形成酶切位点。因此，非互补的5’端DNA臂可以被切割而释放。利用这一原理，结合荧光技术，如图所示，将荧光基标记在非互补DNA链的5’端，而将荧光淬灭基标记在重合的酶切位点3’端方向（见图2B）。这样，只要酶切位点被酶切，标记有荧光基的非互补的5’端DNA链就会被释放，从而与荧光淬灭基分离，使得荧光释放量《计算机学报》2009年12期，2009，32（12）大大提高。这种方法可以有效检测目的片断是否存在。文中还将PCR方法检测目的片断与这种荧光检测法进行了对比，发现该方法比PCR检测具有更高的灵敏度。图2实验原理示意图图3几种逻辑门的构成示意图MilanN.等2003年研制了一种名为MAYA的游戏。这是一种利用特殊的DNA酶E6（一种依赖于DNA的RNA酶）构建起来的逻辑门11。这种酶识别的DNA底物要求具有特殊结构（如3a图所示）。只有当上部寡核苷酸探针与E6的支架区互补，上部寡核苷酸才能被切断释放。将寡核苷酸两端分别标记荧光淬灭基（如罗丹明）和荧光基，那末只有寡核苷酸探针被切断释放，荧光基才能有效激活并释放荧光。这是MAYA游戏进行逻辑判断的主要检测手段。构建有效的空间位阻是实现这个检测手段的关键。当寡核苷酸探针的结合使绿色标记的位阻消失的时候，加速酶切反应；当寡核苷酸探针的结合使红色标记的位阻消失的时候，降低酶切反应。基于以上原理，构建出以下几种逻辑门：YES型、NOT型、AND型和AND-AND-NOT型。YES型逻辑门（图3b所示），当i1寡核苷酸加入时，消除原来i1环状结构，从而标记的荧光探针可以与之结合，并且被切除释放。其判断过称为加入i1，荧光输出。NOT型逻辑门（图c所示）。当加入i6时，环状结构打开，荧光结合的寡核苷酸探针无法结合在互补区域，于是无荧光输出。其判断过程为加入i6，荧光输出停止。AND型逻辑门（图d所示）实际上是将两个YES型逻辑门组装在一起。也就是说，只有当i1和i6都被加入时，才能有荧光输出。AND-AND-NOT型逻辑门（图e）是更为复杂的组合体。必须同时加入i1和i3，才能输出荧光。然而，只要有i6存在，就不会输出荧光。文中解决的问题是在3×3的棋盘中完成3个棋子同线相连。考察所有的逻辑情况后，将所有可能的逻辑门都提前置于棋盘的网格中。再将代表棋子的寡核苷酸分别放入，然后观察荧光输出情况进行判断。2.3与与与与DNA链置换链置换链置换链置换相结合的荧光技术相结合的荧光技术相结合的荧光技术相结合的荧光技术该技术多用来构建DNA逻辑门。其巧妙利用DNA分子的粘贴，通过加入引发链，来释放另一DNA链。在逻辑计算中，这种技术具有循环性、自引发性、反馈性、灵敏性和准确性等特点。近年来在science等高水平科研杂志上都发表了大量系列工作，而且在生物检测领域具有广泛的实际应用前景。2000年，BernardYurke构建了一种DNA链置换机器，在置换过程中可以实现闭合式运动12。2003年，B.Yurke等构建了一种基于DNA链置换的纳米机器《计算机学报》2009年12期，2009，32（12）13。Jong-ShikShin等利用可反复的DNA链置换，构建了可以反复读取和输入的三状态存储器14。2006年，GeorgSeelig等对DNA链相互粘贴、置换的几种模式进行了实验15。2006年，SimonJ.Green等用茎环结构实现了DNA链的粘贴互换16。2007年，DavidYuZhang等实现了DNA链置换的循环进行17。2007年,suvirvenkataraman等实现了通过DNA链自粘贴来完成多段DNA聚合延伸18。下面介绍两个具有代表性的工作。2006年，Georgseelig等报道了一种没有酶参与的DNA逻辑门19。其基本原理如图4-1所示，即先构建好由寡核苷酸链G、Eout、F共同杂交组成的DNA互补结构，再加入Gin寡核苷酸链。此时，由于Gin一侧末端和G的一侧单链末端互补，从而使逻辑门中的G寡核苷酸链被释放，与Gin形成互补双链。此时的互补结构中，只剩下了寡核苷酸链Eout和F。然后再加入Fin寡核苷酸链，Fin的一侧末端与F中间有互补序列，加之Eout本身形成的是单链环状的不稳定结构，于是，F和Fin结合成双链。Eout寡核苷酸链被释放。文中使用了荧光标记地对Eout的释放情况进行了检测（如图4-2所示）。Eq末端标记有荧光基，而Ff末端标记有荧光淬灭基。当其互补结构存在时，荧光恰被淬灭，从而无法检测。但是，当Eq和Ff分离时，荧光就被释放出来，从而表明DNA链的分离情况。上述由G、Eout、F的DNA互补结构就可以构成与门。也就是说，只有同时加入Gin和Fin，才能诱发释放出荧光。值得注意的是，文章并不只是提出这种DNA计算逻辑门，而是将其应用到生物基因检测的中。在鼠脑总RNA中，成功的检测了数个基因的表达情况。图4-1链置换原理示意图图4-2荧光标记原理示意图2008年，PengYin等对这种DNA自粘贴、链置换进行了更为精细的研究20。其主要原理是利用DNA茎环结构的链置换。如图5-1所示，茎环结构A是由at、a、b、bt、ct、c等DNA序列构成的，在茎环结构末端有未互补的单链DNA区域。如果加入与末端单链DNA互补的序列，整个茎环结构就会打开（图中的at与at*可以互补