激光共聚焦显微镜原理

激光共聚焦显微镜原理和应用激光扫描共聚焦显微镜LSCMLASERSCANNINGCONFOCALMICROSCOPE以激光作为光源，激光器发出的激光通过照明针孔形成点光源，经过透镜、分光镜形成平行光后，再通过物镜聚焦在样品上，并对样品内聚焦平面上的每一点进行扫描。样品被激光激发后的出射光波长比入射光长，可通过分光镜，经过透镜再次聚焦，到达探测针孔处，被后续的光电倍增管检测到，并在显示器上成像，得到所需的荧光图像，而非聚焦光线被探测针孔光栏阻挡，不能通过探测针孔，因而不能在显示器上显出荧光信号。这种双共轭成像方式称为共聚焦。因采用激光作为光源，故称之为“激光扫描共聚焦显微镜”。发展历史1957年，MalwinMinsky在其专利中首次阐明了激光共聚焦显微镜技术的基本工作原理，1967年，Egger第一次成功能共聚焦显微镜产生了一个光学横断面，1970年，Sheppard和Wilson推出第一台单光束共聚集激光扫描显微镜1987年，White和Amos在Nature杂志发表了“Confocalmicroscopycomeofage”,标志着LSCM已成为科学研究的重要工具。普通荧光显微镜和激光共聚焦显微镜图像的差别激光共聚焦显微镜的基本原理利用放置在光源后的照明针孔(P1)和放置在检测器前的探测针孔(P2)实现点照明和点探测；激光经过照明针孔形成点光源，由物镜聚焦在样品焦面的某个点上，只有该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光线被探测器阻挡，不能到达PMT探测器，从而提高了成像效果。照明针孔和探测针孔共焦，共焦点为被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面。LSCM的基本组成激光发射器显微镜部分扫描装置计算机系统基本结构——激光光源LASER“Lightamplificationbystimulatedemissionofradiation”受激发射的辐射光放大。激光光源的产生受激吸收：处于较低能级的粒子在受到外界的激发（即与其他的粒子发生了有能量交换的相互作用，如与光子发生非弹性碰撞），吸收了能量时，跃迁到与此能量相对应的较高能级。自发辐射：粒子受到激发而进入的激发态，不是粒子的稳定状态，自发地从高能级激发态（E2）向低能级（E1）跃迁，同时产生光辐射的过程。众多原子以自发辐射发出的光，不具有相位、偏振态、传播方向上的一致，是物理上所说的非相干光。受激辐射：除自发辐射外，处于高能级E2上的粒子还可以另一方式跃迁到较低能级。当一个外来光子带来的能量正好对应能级差时（E2-E1），也会引发粒子以一定的概率，迅速地从能级E2跃迁到能级E1，同时辐射一个与外来光子频率、相位、偏振态以及传播方向都相同的光子的过程。受激辐射激光光源的产生单色性好方向性好亮度高相干和偏振性好激光的特征激光就是受激幅射产生的，激光束里处于相同状态的光子是相干的，偏振的，并沿同一方向传播的。激光器：405，440，635，488，559扫描器系统针孔：confocal一个重要组成部分，它是放在检测器及激光光源前面的一个小孔，作用是控制光切片的厚度，对实现断层扫描成像，排除焦面杂散光起关键作用分光镜：作用是按照波长来改变光线的传播方向。发射荧光分色镜：作用是选择出一定的波长范围的光进行检测，不同型号的仪器采用的分色器的部件有所不同。目前用于分色器的部件主要由滤光片、棱镜和光栅三种类型。检测器：采用高灵敏度的光电倍增管，其检测的范围和灵敏度可根据强度进行连续调节。荧光显微镜系统类型：正置，倒置光路：光源：汞灯、氙灯，观察分辨样品中产生荧光物质的成分与位置。源发滤光片：选择适合荧光物质激发波波长的范围双色分光镜：初步分开激发和发射光组件、阻滤片：获得更纯的发射荧光物镜：激发和发射都由同一物镜实现。目镜：10×用于LSCM的荧光显微镜：侧面有扫描器接口，装有微量步进马达，有防振装置，有光路转换装置，配高数值孔径的物镜。计算机系统数据采集、处理、转换、应用软件基本功能多种图像扫描方式2D:xy，xz，xt3D：XYZ，Xyt4D：XYZt光谱扫描多色荧光同时检测：图像分析与定量处理：3D重建，立体重建，断面轮廓分析。图像分析：特定区域的强度、周长的测量，以及延时观察分析t等。荧光光谱拆分组织和细胞中的荧光来源自发荧光：指组织细胞不经过任何荧光染色便能在短波长光的激发下发射出的荧光，GFP就具有自发荧光，是标记靶蛋白的特异性荧光探针。荧光染色：很多荧光染料与组织细胞作用，能够在光的作用发出特征波长的荧光，借以观察组织细胞的形态结构、化学组成和功能。有些可做活体染色。免疫荧光：荧光抗体法产生荧光。外源性荧光物质进入组织内产生的荧光。某些药物诱发荧光：生物胺类能与某些醛类物质在一定条件下缩合而发生荧光。酶致荧光：某些酶的反应能够发射荧光。LSCM主要用于测定具有荧光的样品，因此对本身没有特征荧光的生物样品，就需要用荧光标记的方法使样品待测物质具有荧光，然后再进行检测。荧光探针荧光标记与荧光探针：采用一定的标记物，使样品待测物质具有特定的荧光特征，这种标记物被称为荧光探针。这种组样品赋予特征荧光的操作过程称为荧光标记。荧光探针的种类：蛋白质、单糖和多糖探针，细胞器探针、核酸探针、细胞活性探针、膜结合受体探针等。如何选择探针根据实验目的确定需要检定的指标确定可供选择的荧光探针的范围：根据需要检测的指标，选择应成熟的探针或标记方法。可通过查找文献和试剂公司产品目录确定可以标记待测物的荧光探针的种类或范围。考虑荧光探针的特性：荧光探针与样品的反应特性（与待测分子或离子反应的选择性或专一性等），荧光探针的灵敏度和荧光强度，荧光探针标记后样品的光谱特征（需要在仪器的检测范围内），荧光的稳定性，样品中多重荧光的相互影响（避免光谱交叉）。荧光样品的制备要求荧光标记反应特异性强，荧光信号定位准确保持样品应有的形态结构的完整性荧光信号响应百准确灵敏，具有可重复性荧光强度适度荧光稳定性好。样品的荧光分布均匀两种或两种以上的荧光信号之间荧光光谱交叉可以得到消除。图象背景干净，干扰杂质少。荧光样品的制备过程样品的预处理组织切片样品的处理：活组织切片，无需固定，可观察和测定活性状态下的一些生理指标，缺点是保存条件高，时间短，切片厚。冰冻切片：荧光背景低，引入杂质干扰少。固定组织切片：易操作，样品易保存，但易引入干扰荧光。细胞样本制备：杂细胞的干扰实验结果，需要注意鉴别细胞的种类和纯度。细胞密度约在20-80%，活的细胞需用专用培养皿。用荧光探针标记样品标记方式：直接标记，生物样品与荧光探针直接作用，使样品具有荧光。间接标记法：荧光探针将某些特定分子标记，这些特定分子再与细胞作用，使样品具有荧光，如免疫荧光法，荧光标记的药物。显微注射法：利用显微注射向细胞内导入荧光探针，此法得到的荧光细胞少，适合监测少量细胞。膜通透法：利用透膜剂，低渗培养液短期刺激增强探针跨膜能力，从而使探针进入细胞中。确定荧光探针标记样品的条件：标记探针的浓度，反应温度，时间等。荧光探针标记的注意事项荧光强度过高：看不清细胞结构细节，不利于形态观察，可降低探针浓度，减少反应时间。荧光强度弱：荧光探针浓度过低，标记条件不当，探针溶解不充分，探针选择错误等。在操作过程中，避免对样品造成损伤防止影响实验结果荧光标记要避光进行。防止非特异性标记，设立正确的对照组。荧光标记后要尽快上机采集图像。LSCM的优越性动态连续扫描及三维图像重组LSCM可以对对活细胞和组织或细胞切片样品的不同层面进行连续逐层扫描,来获得各个层面的图像，即所谓的“无损伤的光学切片”。激光扫描共聚焦显微镜扫描的每个层面之间的间距可以达到0.1um甚至更小。获得的图像通过计算机重组，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。与普通光学显微镜获得的图像相比，LSCM所得到的重组三维图像清晰度高、立体感强,可通过计算机软件对细胞内所研究的结构进行各种测量，对细胞内的空间结构和某些物质在细胞内的定位方面的研究中有广泛的应用。同时多种物质标记利用LSCM，通过对膜上、胞浆内多种物质的荧光标记，可以实现在同一样品上同时进行多重物质的观察，比如检测细胞内钠、钙、镁等离子浓度的比率及动态变化LSCM的优越性瞬时分辨率高可以实时动态观察活体组织标本。LSCM的荧光检测器可以毫秒级或微秒级的速度检测荧光，即其时间分辨率极高，能对细胞内的分子进行功能性动态观察。LSCM技术可对活细胞在无损伤处理的情况下进行观察，跟踪活细胞内的物质或结构和生理过程随时间变化的情况，得到实时动态的连续图像。LSCM的优越性高质量数字图像普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。LSCM以激光为光源，激光具有单色性强、方向性好、高亮度﹑相干性好等优点，可以避免普通显微镜的缺点。一般常用的气体激光器如氩(Ar)﹑氪(Kr)﹑氦(He)﹑氖(Ne)。由于LSCM的样品焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样就避免了传统光学显微镜由于光散射造成的图像信噪比降低，图像清晰度和分辨率不高的缺点。而且，LSCM的图像是以电信号的形式记录下来的，可以采用各种模拟的和数字的电子技术进行各种图像处理。LSCM的优越性LSCM在生物医学中的应用组织和细胞中分子或结构的定位，定量分析：利用LSCM可以在细胞原位用特异的荧光标记探针标记出核酸、蛋白质、多肽、酶、激素、磷脂、多糖、受体等分子，实现对其定位、定性和定量检测，也可观察细胞及亚细胞形态结构。如在细胞原位检测核酸、原位检测蛋白，抗体及其他分子，检测细胞凋亡、细胞器观察及测定，检测细胞整合、观察细胞骨架，检测细胞间缝隙连接通讯等多种应用。标本的制备方法主要有免疫荧光组织和细胞化学法、荧光蛋白标记分子法，荧光细胞染料标记法等。LSCM不但可对单标记或双标记细胞及组织标本的共聚焦荧光进行定量分析，还可利用沿纵轴上移动标本进行多个光学切片的叠加形成组织或细胞中荧光标记结构的总体图像，以显示荧光在形态结构上的精确定位。原位检测细胞中的核酸用于细胞核的定位及形态学观察，检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色体定位观察等。常的荧光探针：PI,EB，DAPI,AO,TOTO-1等荧光原位杂交（FISH）利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。用标记有荧光的DNA或RNA为探针，在原位测组织细胞内特定的DNA或RNA片断，从而对染色体或基因异常的细胞、组织样本进行检测和诊断。把荧光信号的高灵敏度、安全性、直观性和原位杂交的高准确性结合起来。原位检测蛋白质及其它分子常用荧光探针FITC,TRITC,Cy3，Cy5等免疫荧光标记：将抗体标记上荧光素，与细胞或组织内相应的抗原结合后，通过检测特征性的荧光，定位，定性、定量检测样品中的抗体。既有免疫反应的特异性，又有荧光检测的敏感性。荧光蛋白：跟踪组织或细胞内基因表达及蛋白定位的标记物GFP，绿色荧光蛋白，在任何活细胞中都表达，可作为活细胞的分子探针，GFP连接上目的基因后转染细胞，可分析目的基因的生物学功能和特性。可对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察，可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中或外界刺激因子的作用下的时空表达，如某种转录因子的核转位，蛋白激酶C的膜转位，还可用于观察分子的运动，及蛋白之间的相互作用。检测细胞凋亡AnnexinV/PI双染：AnnexinV是检测凋亡早期细胞膜损伤的方法，凋亡早期细胞膜膜磷脂失去平衡，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（PS）会从细胞内侧翻转到外侧，暴露于细胞外环境中，AnnexinV与磷脂具有高度亲和力，可与转移到膜外的PS结合。对于凋亡晚期细胞和死细胞，PI能透膜而使其染红。两者配合使用可以初步确定细胞的凋亡进程。检测细胞器标记线粒体：Rodamin123，JC1,MitotrackerGreenFM,MitoTrackerRed标记溶酶体