荧光显微镜与激光扫描共聚焦显微镜

——聂拾进荧光显微镜原理荧光原理:某些物质经一定波长的光(如紫外光)照射后，物质中的分子被激活，吸收能量后跃迁至激发态;当其从激发态返回到基态时，较大部分则以光能形式辐射出来，由于能量没能全以光的形式辐射出来，故所辐射出的光的波长比激发光的要长，这种波长长于激发光的可见光就是荧光。1、高压汞灯：能发射很强的紫外和蓝紫光足以激发各类物质2、滤色系统:由激发滤板和压制滤板组成a、激发滤板:提供一定范围的激发光b、压制滤板:完全阻挡激发光通过，提供相应波长范围的荧光3、反光镜:一般采用平面反光镜4、聚光镜:用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成5、物镜和目镜：最好使用消色差物镜和低倍目镜荧光显微镜的组成荧光显微镜原理基本原理：利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。高压钠灯紫外光蓝光绿光存在荧光物质的样本形成荧光光学图像滤镜分光激发光学成像荧光显微镜工作原理荧光显微镜的种类透射式荧光显微镜：激光光源通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的落射式荧光显微镜：激光从物镜向下落射到标本表面即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜激光扫描共聚焦显微镜由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制(包括数据采集，处理，转换，应用软件)，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活的运行。显微镜光学系统计算机控制系统扫描装置检测系统激光光源采用激光束作光源，激光束经照明针孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本焦平面上每一点进行扫描。组织样品中的荧光物质，受到激发后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔时先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管(PMT)探测收集，并将信号输送到计算机。计算机将被探测点显示在计算机屏幕上，扫描系统在焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共聚焦图像。激光扫描共聚焦显微镜工作原理成像清晰：在这个光路中，只有在焦平面的光才能穿过探测针孔，焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的，不能通过小孔，造成非观察点的背景呈黑色，反差增加。共聚焦：由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔与探测针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像。可实现连续扫描，可动态记录变化激光扫描共聚焦显微镜特点