SDS-PAGE蛋白凝胶电泳

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）实验流程配胶样品制备电泳（1.5~2h）染色（20min）脱色（30min~2h）分析配分离胶(下胶)配浓缩胶(上胶)实验过程1.装配装置BG-verMINI型迷你垂直电泳槽(北京百晶)2.凝胶配制实验过程*Acr有神经毒性下胶(分离胶)10%上胶(浓缩胶)5%H2O3.9ml3.4ml30%Acr-Bis3.3ml0.83mlBuffer(含SDS)(1.5MTris-ClpH8.8)2.6ml(1MTris-ClpH6.8)0.68ml10%APS200ml100mlTEMED10ml10mlTOTAL10ml5ml加入分离胶溶液pH8.8封水或饱和正丁醇溶液出现明显界面时，分离胶凝聚完成（10~20min）倒出水或正丁醇，并用加样枪/滤纸吸干制备分离胶(下胶)封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。分离胶pH8.8加入浓缩胶溶液pH6.8制备浓缩胶(浓缩胶)样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。插入样品梳1.SDS2.-mercaptoethanol3.bromophenolblue4.GlycerolSamplebuffer样品处理ssSHSH金属浴(100℃)中15minSamplebuffer加入电极缓冲液pH8.3浓缩胶pH6.8通电分离胶pH8.8加入样品上样及电泳开始电压恒定在80V，当进入分离胶后改为120V，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。StakinggelSeparatinggel电流路径负极正极内槽外槽凝胶外槽————实验过程5.染色、脱色A.染色20分钟B.脱色30分钟至2小时考马斯亮兰R250蛋白质的染色方法•氨基黑血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳•考马斯亮兰R-250，G250G250测定蛋白含量•银染敏感度最高，常应用于蛋白质双向电泳聚合原理CH2CHCNH2OCH2CHCNHOCH2CH2CHCNHOCH2CHCNH2OCH2CHCNH2OCH2CHCNH2OCH2CHCNH2OCH2CHCNHOCH2CH2CHCNHOCH2CHCNHOCH2CH2CHCNHOCH2CHCNH2O()nCH2CHCNH2O()nCH2CHCNHOCH2CH2CHCNHOCH2CHCNH2O()nCH2CHCNHOCH2CH2CHCNHOCH2CHCNH2O()nCH2CHCNH2O()n+*Acr有神经毒性n决定了交联度与浓度一起决定孔径的大小过硫酸铵是催化剂TEMED是加速剂蛋白质是29：1核酸是19：1实验原理1、带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。电荷分子大小分子形状实验原理•浓缩效应Cl-Gly-Cl-Gly-Cl-Gly-PH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Gly-Gly-主要离子氯离子甘氨酸离子(pI5.97)蛋白质离子Gly-Gly-Pr-Pr-Pr-PH8.8Pr为什么带负电加样缓冲液二硫键盐键疏水作用氢键巯基乙醇断二硫键SDSCH3SO4Na断化学键带负电荷甘油SDS：Pr=1.4:1NC氨基酸侧链促沉溴酚兰Tris?实验原理•浓缩效应Cl-Cl-Cl-pH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-主要离子氯离子甘氨酸离子(pI5.97)蛋白质离子Pr-Pr-Pr-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-pH8.8快慢离子的产生高的电压梯度Pr-运动加速实验原理•浓缩效应Cl-Cl-Cl-pH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-主要离子氯离子甘氨酸离子(pI5.97)蛋白质离子Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-pH8.85%10%快慢离子的产生高的电压梯度Pr-运动加速浓缩效应实验原理•分子筛效应pH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-主要离子氯离子甘氨酸离子(pI5.97)蛋白质离子pH8.85%10%甘氨酸解离增加无快慢离子Pr-根据分子量运动分子筛效应Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-实验原理•分子筛效应pH6.8主要离子氯离子甘氨酸离子(pI5.97)蛋白质离子pH8.85%10%甘氨酸解离增加无快慢离子Pr-根据分子量运动分子筛效应Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-实验原理•分子筛效应pH6.8pH8.85%10%lgMw电泳迁移率lgMw=-bx+KPrMw在11.7-165Kd实验原理•分子筛效应pH6.8pH8.85%10%迁移率=蛋白质移动的距离脱色后的胶长染色前胶长指示剂移动的距离实验原理迁移率=“蛋白质移动的距离”指示剂移动的距离染色前染色后蛋白质的带在哪呢？L1L2L3L4LxL1XL3L2XL4PageRulerPrestainedProteinLadderAprestainedSDS-PAGEMWmarkerwithcontrastingcoloredreferencebandsat10and70kDa.976644292014MarkerTanon-1600数码凝胶图像分析系统GIS1D图像分析软件(Ver.4.00)诱导前后蛋白表达差异IPTG诱导表达His-GFP融和蛋白（31.9kD）。1为诱导前，2～6分别为诱导0.5,1,1.5,2,2.5hrs。电泳过程中的不正常现象1“微笑”现象指示剂前沿呈现两边向上的曲线形，主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。2皱眉现象由于垂直电泳槽的装置不合适引起的，特别是当明胶和玻璃板组成的“三明治底部有气泡”或靠近隔片的凝胶聚合不完全处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。3“拖尾”现象样品溶解不佳引起或分离胶浓度过大解决办法：加样前离心选择合适的样品缓冲液和凝胶缓冲液加增溶试剂降低凝胶浓度4“纹理”现象样品中的不溶性颗粒引起的解决办法：增加溶解度离心除去不溶性颗粒5偏斜现象电极放置不平行或加样位置偏斜引起6-2整块胶分离的条带太宽主要是未浓缩好的原因处理办法：•适当增加浓缩胶的长度；•保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；•适当降低电压；6-1某一条泳道条带太宽加样量太多或者加样孔泄露引起7.“鬼带”“鬼带”就是在跑大分子、构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却与目标条带有相同的免疫学活性，WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。谢谢!附：蛋白质的提取与定量方法•蛋白质提取•不同来源，不同的方法提取原则•细胞的破碎•合适的裂解液•一般在冰上进行•加入适当的蛋白酶抑制剂哺乳类细胞的裂解液-RIPA•50mMTris-HCl(pH7.4),•150mMNaCl,•1%NP-40（乙基苯基聚乙二醇，常用非离子性去垢剂）,•0.1%SDS蛋白酶抑制剂抑制剂靶蛋白酶PMSF苯甲基磺酰氟丝氨酸蛋白酶EDTA金属蛋白酶Leupeptin亮肽素丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶Aprotinin抑肽酶胰蛋白酶及糜蛋白酶Pepstatin抑肽素天冬氨酸蛋白酶定量方法•紫外吸收法•BCA法•Lowry法•Bradford法以双缩脲为基础的方法1.BCA法bicinchoninicacid二奎啉甲酸法以双缩脲为基础的方法2.lowry法folin酚法磷钨酸和磷钼酸钨蓝、钼蓝BCA和Lowry法比双缩脲灵敏高100倍0.005-0.10mg/mlBradford法•考马斯亮蓝G250染色法•此法根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。•与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。•反应化合物在595nm处有最大光吸收值•灵敏度25mg/ml~200mg/mlSDSTriton-X100Tween20,60,80EDTADTT-巯基乙醇BCA5%5%5%10mM1mM1mMBradford0.1%0.1%0.06%5mM1M注意各方法适用条件—范围选择蛋白质定量方法时应考虑•实验对测定所要求的灵敏度和精确度；•蛋白质的性质；•溶液中存在的干扰物质；•测定所花费的时间等。