溶菌酶

溶菌酶•组员.刘英炜，甘文圣，牛根坡，石方.一·溶菌酶定义：溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramideglycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。二·溶菌酶是如何被发现的？1922年的一天，正在感冒的英国细菌学家AlexanderFleming发现，把一些鼻粘液加入细菌的培养基后会引起细胞的溶解。而这种存在于鼻粘液中的能杀死细菌的重要物质被认为是一种酶，Fleming命名其为溶菌酶（Lysozyme）。在1965年,DavidPhillips和他在牛津的同事以0.2nm分辨率的X射线晶体结构分析法阐明了溶菌酶的三维结构.溶菌酶相对分子质量为14.6X103，由129个氨基酸组成的单肽链蛋白质，含有4对二硫键。溶菌酶分子近椭圆形，大小为4.5nmX3.0nmX3.0nm。它的构象比较复杂，α螺旋仅占25%，在分子的一些区域有伸展着的β片层构象。三.溶菌酶分布1.1鸡蛋清溶菌酶：鸡蛋清溶菌酶占蛋清总蛋白的3.4％～3.5％，作为溶菌酶类的典型代表，是目前重点研究的对象，也是了解最清楚的溶菌酶之一。它由18种129个氨基酸残基组成，具有4个S-S键，其分子量为14000，最适pH为6～7。在pH4～7、100℃处理1分钟不失活.鸡蛋清溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖，其水解位点是N-乙酰胞壁酸(NAM)的1位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的4位碳原子间的β-1，4糖苷键。肽聚糖是细菌细胞壁的主要成份，它是由NAM、NAG和肽“尾”(一般是4个氨基酸)组成，NAM与NAG通过β-1.4糖苷键相连，肽“尾”则是通过D-乳酰羧基连在NAM的第3位碳原子上，肽尾之间通过肽“桥”(肽键或少数几个氨基酸)连接，NAM、NAG、肽“尾”与肽“桥”共同组成了肽聚糖的多层网状结构，作为细胞壁的骨架，上述结构中的任何化学键断裂，皆能导致细菌细胞壁的损伤。对于G+细菌与G-细菌，其细胞壁中肽聚糖含量不同，G+细菌细胞壁几乎全部由肽聚糖组成，而G-细菌只有内壁层为肽聚糖，因此，溶菌酶对G+细菌的作用优于对G-细菌的作用。1.2人及哺乳动物溶菌酶：人溶菌酶存在于眼泪、唾液、鼻粘液、乳汁等分泌液以及淋巴腺和白血球中，1ml眼泪中含7mg溶菌酶，1ml乳汁中含0.1～0.5mg。人溶菌酶由130个氨基酸残基组成，有4个S-S键，分子量为14600，其溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高3倍。对于哺乳动物溶菌酶，目前仅从牛、马、羊等动物的乳汁中分离出溶菌酶，其化学性质与人溶菌酶相似，但结构尚不清楚，其溶菌活性也远低于人溶菌酶约3000倍。人及哺乳动物溶菌酶的作用机制与鸡蛋清溶菌酶相同。1.3植物溶菌酶：目前已从木瓜、无花果、芜菁、大麦等植物中分离出溶菌酶，其分子量较大，约为24000～29100。植物溶菌酶对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1/3，但对胶体状甲壳质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的10倍。1.4微生物产生的溶菌酶：人们从60年代开始，发现微生物也能产生溶菌酶，并且进展很快。目前微生物产生的溶菌酶大体上分以下5种：（1）内N-乙酰已糖胺酶，此酶同于鸡蛋清溶菌酶，破坏细菌细胞壁肽聚糖中的β-1，4糖苷键。（2）酰胺酶，切断细菌细胞壁肽聚糖中NAM与肽“尾”之间的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸键。（3）内肽酶，使肽“尾”及肽“桥”内的肽键断裂。（4）β-1，3、β-1，6葡聚糖酶和甘露聚糖酶，此酶分解酵母细胞的细胞壁。（5）壳多糖酶，这是分解霉菌细胞壁一种溶菌酶。四·溶菌酶的制备.分离.活力测试实验原理：溶菌酶（lysozyme）是由弗莱明在1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称为1，4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。活性中心为天冬氨酸52和谷氨酸35，是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰胞壁酸（NAM）间的β-1，4糖苷键，相对分子质量14700Da，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50OC，最适PH为6～7左右。在280nm的消光系数[]为13.0。该酶活性可被一些金属离子Cu2+、Fe2+、Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+、Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。【实验材料】1.实验器材循环水式真空泵HSB-IⅡ;蛋白紫外检测仪;记录仪;紫外分光光度计;梯度混合器(500mL);721型光分光光度计;冰冻离心机；冰箱；透析袋；酸度计；部分收集器；恒流泵；圆盘电泳装置；恒温水浴锅；层析柱(2.6×50cm)(1.6×30cm)；布氏漏斗(500mL)；吸滤瓶(1000mL)；G-3砂芯漏斗(500mL)2实验试剂⑴鸡蛋清（鲜鸡蛋）⑵底物微球菌粉⑶D152大孔弱酸性阳离子交换树脂⑷固体氯化钠（NaCl）；固体硫酸铵(NH4)2SO4；固体磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）；固体磷酸二氢钠（NaH2PO4•2H2O）；固体磷酸钠（Na3PO4）⑸乙醇；蒸馏水；甲醇；考马斯亮蓝；三氯醋酸；丙酮(6)溶菌酶标准品；SephadexG50⑺N-乙酰葡萄糖胺；硫酸铜；硫酸亚铁；硫酸锌；氯化镁；氯化钙；氢氧化钠；盐酸⑻SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂；蛋白含量测定（福林法）试剂⑼聚乙二醇-20000、两性电解质【实验操作】1.蛋清的制备将4～5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出（鸡蛋清pH值不得小于8），轻轻搅拌5分钟，使鸡蛋清的稠度均匀，用两层纱布过滤除去脐带块，量体积约为100ml。2.鸡蛋清粗分离按过滤好的蛋清量边缓慢搅拌边加入等体积的去离子水，均匀后在不断搅拌下用1mol/LHCl调pH值至7左右，用脱脂棉过滤收滤液。3.D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析⑴D152树脂处理：将D152树脂先用蒸馏水洗去杂物，滤出，用1mol/LNAOH搅拌浸泡并搅拌4～8小时，抽滤干,用蒸馏水洗至近pH7.5,抽滤干,再用1mol/LHCl按上述方法处理树脂，直到全部转变成氢型，抽滤干HCL,用蒸馏水洗致近pH5.5，保持过夜，如果pH之不低于5.0，抽滤干HCL,用2mol/LNAOH处理树脂使之转变为钠型，pH值不小于6.5。吸干溶液，加pH6.50.02mol/L的磷酸盐缓冲液平衡树脂。⑵装柱：取直径1.6cm，长度为30cm的层析柱，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，再加入一些树脂，至树脂沉积至15～20cm高度即可。于柱子顶部继续加入pH6.5,0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡树脂，使流出液pH为6.5为止，关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面1cm左右。⑶上柱吸附：将上述蛋清溶液仔细直接加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内，流速为1ml/min。⑷洗脱：用柱平衡液洗脱杂蛋白，在收集洗脱液的过程中，逐管用紫外分光光度计检验杂蛋白的洗脱情况，当基线开始走平后，改用含1.0mol/LNaCl的pH值6.5，浓度为0.02mol/L磷酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱液。⑸聚乙二醇浓缩：将上述洗脱液合并装入透析袋内，置容器中，外面覆以聚乙二醇，容器加盖，酶液中的水份很快就透析膜外的聚乙二醇所吸收。当浓缩到5mL左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出浓缩液。(6)透析除盐：蒸馏水透析除盐24小时。4.SephadexG50分子筛柱层析⑴装柱：先将用20%乙醇保存的SephadexG50抽滤除去乙醇，用6g/LNaCl溶液搅拌SephadexG50数分钟，再抽滤，反复多次直至无醇味为此。(如果SephadexG50是新的，则按实验五中的方法处理凝胶)。加入胶体积1/4的6g/LNaCl溶液，充分搅拌，超声除去气泡，装入玻璃层析柱（1.6×50cm），柱床45cm。⑵上样：与实验五中的方法相同。⑶洗脱:样品流完后，先分次加入少量6g/LNaCl洗脱液洗下柱壁上的样品，连接恒流泵，使流速为0.5mL/min，用部分收集器收集，每10分钟一管。⑷聚乙二醇浓缩：合并活性峰溶液，用聚乙二醇浓缩到5mL左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出浓缩液。⑸透析除盐:蒸馏水透析除盐24小时。收集透析液，量取体积。5.溶菌酶活力测定⑴酶液配制：准确称取溶菌酶样品5mg,用0.1mol/L,pH6.2磷酸缓冲液配成1mg/ml的酶液，再将酶液稀释成50µg/ml.⑵底物配制：取干菌粉5mg加上述缓冲液少许，在乳钵中（或匀浆器中）研磨2分钟，倾出，稀释到15～25ml，此时在光电比色上的吸光度最好在0.5～0.7范围内。（3）活力测定：先将酶和底物分别放入25℃恒温水浴预热10分钟，吸取底物悬浮液4mL放入比色杯中，在450nm波长读出吸光度，此为零时读数。然后吸取样品液0.2mL（相当于10µg酶），每隔30s读1次吸光度，到90s时共计下四个读数。活力单位的定义是：在25℃，pH6.2，波长为450nm时，每分引起吸光度下降0.001为1个活力单位。酶的活力单位数=△A450nm/t×0.001比活力=酶的活力单位数/mg蛋白质四.溶菌酶的作用机理溶菌酶种类及作用机制溶菌酶按其所作用的微生物不同分两大类，即细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。细菌细胞壁溶菌酶有两种，一种是作用于β-1，4糖苷键的细胞壁溶解酶，另一种是作用于肽“尾”和酰胺部分的细胞壁溶解酶。真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细胞壁溶解酶和霉菌细胞壁溶解酶。溶菌酶广泛地分布于自然界中，在人的组织及分泌物中均可以找到，动物组织中也有，以鸡蛋清中含量最多。其它植物组织及微生物细胞中也存在。根据来源不同，其性质及作用机制略有差异。溶菌酶的内部几乎全部是非极性的。疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起重要作用。在溶菌酶分子的表面，有一个比较深的裂缝，其大小恰好能容纳多糖底物的6个单糖，这是溶菌酶的活性部位。溶菌酶是一种葡糖苷酶，能催化水解NAM的C1和NAG的C4之间的糖苷键，但不能水解NAGC1和NAMC4之间的β（1-4）糖苷键。几丁质是甲壳类动物甲壳中所含的多糖，仅由NAG残基通过β（1-4）糖苷键连接而成，几丁质也是溶菌酶的底物。用大小不同的NAG寡聚体作底物测定被溶菌酶水解的相对速率，结果发现，少于4个糖的寡聚体水解速率甚小，当由四聚体增加到五聚体时，水解速率猛增500倍，五聚体增加到六聚体，速率增加近8倍，六聚体增加到八聚体，速率不再变化。这种情况与X射线晶体结构分析结果一致，活性部位所在的裂缝(cleft)正好被6个糖残基所装满。（NAG）3是溶菌酶的竞争抑制剂，因此A-B，B-C糖苷键均不可能是被水解的键。C环的空间对NAM来说体积太大，只能是NAG。C-D也不可能成为裂解的部位，而NAM不能适合到部位C中，进一步排除了另外一个裂解部位：E-F键。胞壁多糖是一个NAM和NAG交替的高聚物，从而NAM不能占据部位C时也就不能占据部位E。细菌的细胞壁多糖恰好具有NAM-NAG键，所以水解部位只能发生在D-E之间。进一步的问题是酶的催化作用，究竟键是在糖苷键原子的哪一侧被裂解的？用X射线晶体结构分析法研究了竞争性抑制剂（NAG）3仅仅占据了大约半个裂缝。从活性部位的几何大小看出酶的最小底物应该是（NAG）6。实验中用（NAG）6为底物，确实能被酶迅速水解。酶活性部位刚好能容纳一个六糖分子，A、B、C、D、E、F表示6个糖残基的位置，只是第4个糖残基D环因空间的原因必须由正常的椅式变形为能量较高的半椅式或“沙发”构造。因此糖苷键的稳定性减低，键就容易从这里断裂。在H218O溶液中酶促水解底物（NAG）6，发现只有D糖C1上含有18O，而E糖的C4羟基只含普通的O，由此可知这个键断裂在D糖基的C1和E残基的糖苷键的O之间。分析D-E键周围的微环境，最活泼的基团显然是Asp52和Glu35，它们分别位于糖苷键两侧。Asp52位于糖苷键的一侧，而Glu35在另一侧。五.溶菌酶的应用