3.MTT测定细胞增值抑制率

一、试验原理MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。二、试验准备1.MTT的配置MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20℃长期保存，避免反复冻融。最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。可把MTT粉末称量分装在EP管里，用的时候现配。当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。配制MTT时用PBS（pH=7.4）溶解，60℃水浴助溶。MTT加入细胞前还是需要以过滤的方式灭菌为宜MTT有致癌性，MTT对细菌很敏感，配成的MTT需要无菌。往96孔板加MTT时可以把操作台及周围上的照明灯关掉。MTT一般是过量的，所以96孔板中10uL足够。培养基超过100uL，MTT按照10%的比例加入。MTT与培养基振荡混匀。2.DMSO在同一实验中不要更换DMSO，DMSO的量可为100uL或150uL。加DMSO前把孔中液体尽量弃干净。否则一是沉淀会很难溶解，二培养液的颜色在检测时也能被测到，会对最后结果造成影响。但前提是不能把细胞结晶沉淀也一起吸掉。加了DMSO后用振荡器轻轻振荡5-10min，时间控制尽量严格一点，放置时间长了会影响结果，值会偏大，且结果不可信。放入37℃放孵育箱15min溶解结晶。三、实验操作1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100uL铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔（边缘孔用无菌PBS填充）。2.5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物。原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药。一般5-7个梯度。每孔100uL，设3-5个复孔。建议设5个，否则难以反应真实情况。3.5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。4.每孔加入20uLMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先吸弃去培养液，小心用PBS润洗2-3遍后，再加入含MTT的培养液。5.终止培养，小心吸去孔内培养液。6.每孔加入150uL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm/570nm处测量各孔的吸光值。7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。四、预实验及注意事项正式试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及接种不同细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。保证MTT结晶形成数量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。1.药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。2.时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。3.培养时间。200ul的培养液对于104～105增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液。4.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。5.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养基、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。6.避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。7.接种时最好按照预实验摸索出的密度接种，因为细胞密度在10000/ml左右时，所测得的OD值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关系最好，结果最可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显，太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快营养会不够，最后导致死亡。且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。细胞密度要根据不同细胞的特点来定。如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度，如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度，这样与对照的区别更明显，数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105，贴壁细胞可为103-104。最佳点板浓度在4000-5000/孔，太少的话SD值会很大。（对于不同的细胞，每孔细胞数要摸索一下，对照组OD在1.4以下为佳，当然通常来说更不要超过2。8.注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。虽然移液器比移液管精确得多，但是如果操作不熟，CV会在8%左右。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练些、快些上板。