小鼠海马LTP

一．背景知识Morris水迷宫实验是检测动物空间学习记忆功能的重要行为学方法，海马LTP实验可以了解突触可塑性变化，反映行为学的发生机制。脑片是指从动物脑区制备的厚度为100~700μm能够在体外存活一定的时间的脑薄片，脑片技术起始于20世纪50年代Li和McIlwain的离体脑片电生理研究。脑片兼有在体脑实验和离体神经细胞培养的某些特点，在体外48小时内依然能保持良好的活性，离子通道性质不会发生变化，离体脑片保持有完整的神经突起和神经解剖通路，便于研究突触活性。在脑片的电生理过程中排除了活体血压、温度、电解质、血脑屏障等因素的干扰，可以按不同的实验目的直接准确地改变脑片灌流液的成份和条件，如温度、酸度和渗透压、通氧状态、以及离子通道或细胞信号转导通路的阻断剂等；还能借助显微镜准确地放置记录电极和刺激电极。维持脑片活性有两种不同的技术：交界式脑片孵育：脑片部分浸入人工脑脊液（ACSF）中，上表面暴露在湿化的含95%O2和5%CO2的气体，这种孵育方式，脑片得到氧气是通过氧气在脑片上表面的扩散；全浸式脑片孵育：脑片全部浸入在人工脑脊液中，在这种孵育方式中，脑片是从溶解在人工脑脊液中得到氧气。孵育脑片方式的选用取决于实验目的。例如当采用共聚焦成像技术时采用全浸式脑片孵育。这两种不同的脑片孵育方式对脑片的细胞生理有不同的影响，例如，最近研究发现α-钙调蛋白依赖性激酶ІІ的磷酸化，这种酶在LTP诱导中起关键作用，在全浸式脑片中短暂升高，而在交界式脑片孵育方式中则持续降低。脑片切片后，必须恢复1.5小时后才开始记录，在恢复和记录过程中不一定要采用同一种孵育方式。离体脑片上做LTP实验，周围环境容易控制，可以人为调节ACSF里面的离子成分到需要的浓度，而且可以持续给予脑片通饱和氧和二氧化碳，维持脑片的活性，还可以控制记录时候的温度，方便给予稳定浓度的药物，可控性比较好，比较适合研究急性药物对突触可塑性的影响。但是对切脑片的技术要求比较高，可以说脑片切的好不好决定实验的成败，在切脑片的时候手法很重要，当中有很多的窍门，一点做不好就会导致实验的失败。而在体实验对于动物手术的要求很高，尤其以刺激和记录电极的定位最为重要，必须严格按照图谱上的位置来放置电极，如果需要重复刺激的话还要用牙科水泥固定电极以防止脱落，术后感染和电极脱落是导致实验失败的常见原因。但是这个实验容易受到动物本身状态的影响，因为有些细胞和体液因子在离体实验中是没有的，对于海马LTP是有影响的，而且在体实验保留的神经通路和联系较离体实验更多，实验机制更复杂，也最能真实客观的反映LTP的变化，据报导在体实验中诱发的LTP可以持续几天甚至几周，而离体脑片上只能持续几个小时。切全脑片和分离海马后再切都可以，但是如果分离海马需要经过一段时间的训练才能取的好。有的文章里面说要切断CA1和CA3之间是为了防止海马脑片从CA3传入CA1的兴奋性纤维自发电活动引起细胞的癫痫样放电，你可以把一片剃须刀片从中间折断成两片，然后取一小截刀刃，插到一根棉签木棍上来切断。二．脑片制备方法1.取C57小鼠，用乙醚麻醉后快速断头，切开头皮去除颅骨和硬脑膜。迅速取出全脑置于0~4℃且用95％的02和5％的C02饱和的人工脑脊液(ACSF)中稍加冷却，其成分为(mmol／L)NaCl120，KCl2.5，CaCl22.0，NaH2PO41.25，NaHC0326，MgS042.0，葡萄糖10，氧饱和后，pH为7.4。2.切去小脑和1／3前脑，将大脑沿正中线一分为二，由脑腹内侧沿皮质边缘分出海马，用胶水将含有海马的脑组织块固定在载物浴碟上。3.用振动切片机冠状面切厚度为400微米的脑片。4.将脑片放在孵育槽中浸在液面下的尼龙网上，不断充以混合气，并置于34℃恒温水浴槽中孵育0．5h，然后置于室温(26±1)℃孵育待用，2～3h后开始实验。三．离体脑片电位记录1.实验时取1个孵育后的脑片置于半浸式恒温浴槽的尼龙网上，浴槽内恒温32℃。脑片上方持续通入95％02和5％C02混合气体，脑片下方为未充氧ACSF恒速灌流（1~2mL/min）。2.在手术显微镜直视下，将尖端裸露的双极金属钨丝刺激电极，置于CA3区Schaffer侧支路径上，刺激电极经隔离器与刺激器相连接，刺激波宽100~300μs，刺激强度0.1~0.6mA，刺激间隔2~10s。记录电极为充以4mol/LNacl的玻璃微电极，尖端直径1~1.5μm，电极阻抗2~10MΩ，记录电极经微电极放大器与记忆示波器和记录仪相接，并连接数据采集和处理系统。3.实验时，将记录电极置于CA1区锥体细胞层，记录到的诱发电位可同时显示在记忆示波器和计算机显示屏上，进行随机或脱机处理。记录结果也可用X-Y记录仪描记。四．注意事项1.电刺激。2.生物放大器：正确选择，植物性神经冲动幅度多为50-100μV。不同组织，应采用不同的参数。如ECG：振幅0.1-2mV,灵敏度0.5-1mV，时间常数0.1-1.0s，高频滤波1KHz植物性神经冲动：振幅50-150μV,灵敏度25-100μV，时间常数0.01-0.1s，高频滤波3-5KHz中枢神经元单位放电：振幅100-300μV,灵敏度50-100μV，时间常数0.01-0.1s，高频滤波5-10KHz3.玻璃微电极：常用尖端0.5-5μm，向细胞内插入时，需小于0.5μm（细胞直径的1/10~1/100），且尖端的倾斜度应相当缓和，一般微电极可分为金属微电极和玻璃微电极两类。金属微电极，现多用镀铂钨丝电极（platinum-platedtungstenelectrode），在钨丝上镀铂，可极大改善电极的电学特性，噪声可大大降低，加之机械强度大，适合长期体外记录。现也常用镀银碳纤维电极。玻璃微电极记录易受机械位移的影响，加之尖端的电解质会漏出或堵塞，不适合半小时以上的长时间记录，玻璃微电极可分单管和多管微电极。毛坯管在国外多用Pyrex管，国内多用GG-17和95料玻管。细胞外记录多采用外径1.5-2mm玻璃，细胞内记录则采用外径1mm细玻管，内外径之比约为2：3或5：6，长6-8cm。拉制前必须经过清洁处理。清洁液：用等量的（250ml）王水（可反复应用）。一般毛坯管捆成把放入清洁液中1-2h，取出自来水冲洗20-30min，再放入无水酒精中洗涤，再放入盛满蒸馏水烧杯中加热煮沸10min，倒去蒸馏水，再换新蒸馏水反复3次，再放入烤箱中烤干，备用，切不可用市售的洗涤剂，以防降低电极充灌液的表面张力而影响冲灌。充灌液常用3mol/LKCl，为避免Cl-扩散，也可用2mol/L醋酸钾或柠檬酸钾充灌，也有人用0.5-1mol/LNaCl（低浓度）充灌可降低噪音。细胞外记录时，最后再用3-4mol/LNaCl+2%旁胺天蓝溶液定位。在膜片钳中还常加钙螯合剂，如EGTA。阻抗与不同组织相关。4.电生理实验中噪声和干扰的形成和排除。（一）来源。1．干扰信号与生物电生理信号的鉴别。准确区分生物电信号与干扰的伪迹是电生理实验的先决条件。2．来源。主要有三个方面：其一。物理性干扰。1）静电和电磁的干扰：实验室附近高压电，室内日光灯可产生50Hz的静电干扰，尤其是交流电，尤其是50Hz频率干扰最大（电子设备为50Hz）。其特点是幅度大，波形规则。2）噪声干扰：电子元件本身产生杂乱无章电压和电流称噪声，一般与放大器内部元件的质量与性能有关。其二。接地不良。1）地线电阻应小。2）仪器故障。产生漏电电流，在地线上形成电位差，产生干扰。3）地线行走过程中打圈，形成线圈，易接受电场和磁场的干扰。4）各仪器设备应采用一点接地的方式，若采用多点接地，形成大地回路，也会引起干扰。5）地线过长与电源线形成交流环路。6）误用市电三孔中性线作为大地线（中性线上有4-5A电流）。其三。生理性干扰。1）大脑电活动时，眨眼、眼球运动均对脑电具有干扰作用。2）实验中环境温度过低，动物寒战、抖动，引起肌电的发放而干扰记录，或因呼吸运动引起记录部位机械位移引起干扰信号。3）心电干扰，频率与心电一致。（二）排除。1．物理性干扰。1）屏蔽法：用于低频电和静电干扰，屏蔽线分布电容较大，线与线之间不可平行排列，更不可为了美观而将多线扎在一起，这会加大分布电容，易偶合高频干扰噪声。2）远离法。3）改变位置法。依电流方向相反，产生反向磁场的原理，改变各个仪器的位置或放大器输入的方位，会使干扰磁场抵消，微电极放大器探头阻抗高，易引入干扰，实验前可反复调整其方向和位置。4）微电极记录时尽量减少微电极本身的阻抗，减少输入阻抗及干扰信号在这个阻抗上形成干扰电压降，微电极到探头的连线5cm。5）用监听器监听噪声，以便及时排除。2．仪器质量，尽量改进。3．接地不良。地线应尽量短粗，不能与电源线平行或打圈，不要接在电源线的中性线上，地线单独埋设，埋置处应较潮湿，附近无大型变压电动机，并在坑内加些食盐。4．检查各仪器是否漏电。5．慢生物电变化时用乏极化电极，实验对象宜安静，勿受振动。（三）刺激伪迹过大及防止。1）尽量减少刺激脉冲的波宽和强度。2）在动物体或标本上，尽量延长刺激部位的距离，在刺激电极和引导电极之间加一接地电极，此电极离引导电极愈近，刺激伪迹就越小；采用变换刺激极性，结合叠加处理，可抵消伪迹。注：微电极中高浓度充灌液易蒸发，造成电极回路的开路，因此常在微电极插入Ag-AgCl丝或铂金丝后，在微电极尾部开口处涂上一层凡士林，防止水分蒸发。动物麻醉和制动下，体温会下降，故应保温调节，加温维持肛温36-38℃.记录脊髓背角或腹角神经元将脊柱前后拉直以减小呼吸运动造成的位移。记录脑神经元应在表面用温热石蜡制成一油槽，防止血管博动和呼吸运动的影响。5.细胞内微电极记录多用幼年离体标本，其原因：1）幼年动物骨骼骨化不完全，结缔组织少，神经组织易于分离，标本耐缺氧能力强，有的标本可存活数小时至数天，但标本也可能发育不完全，如背根和脑干到脊髓的投射纤维要到三周动物才完全。神经纤维髓鞘化不全，其药理作用与成年动物也不同。从实验角度上讲，脊髓背腹根短，不利于电生理刺激记录。小鼠一般应小于15g，制备标本才有可能成功，而这样小鼠背腹根神经节不利于电生理实验。最适合的动物是金黄地鼠（hamster），介于大小鼠之间，制备标本活性很好，可能与其冬眠习性有关，而且其脊髓背腹根长达20-25mm，利于电生理记录。动物选择仍依实验而定，同一标本，不同中枢结构对缺氧耐受力也不同。金黄地鼠，若观察脊髓背角神经元活动，可用150-160g体重的鼠均可，但要研究腹角神经元，则体重不宜超过30g。离体标本的灌流注，如ACSF。其中缓冲液成分有两种，一是重碳酸盐（bicarbonate）：温度低（4℃），配方有利于降低组织兴奋性。二是磷酸盐缓冲液和HEPES缓冲液：其优点是接近于人体环境。各种缓冲液一般都先配母液，临用前一天，或临用前稀释。