PCR体系

PCR反应体系模板：单链或双链DNA引物：1对长16-30bp的寡核苷酸(决定扩增产物特异性的关键)DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶(常用Taq酶或Pfu酶)底物：四种脱氧三磷酸核苷dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTPMg2+：DNA聚合酶的激活剂PCR反应体系的五要素：3通用PCR反应体系组分终浓度10×PCRbuffer1×MgCl21-4mM（常用1.5mM）dNTP0.2mMeach（200uMeach）PrimerF0.1-1.0uMPrimerR0.1-1.0uMTemplateDNA0.01-10ngTaq(Pfu)0.2-1UddH2OUptofinalvolumeTotalvolume15-50uL某些公司生产的buffer会预先含有Mg离子，因此不必额外再添加Mg离子。4①缓冲液(buffer)：提供合适的pH值和DNA聚合酶的激活剂10mMTris·HCl（pH8.3-9.0），1.5mMMgCl2，50mMK+多次冻融会使dNTP降解。如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。Mg2+浓度过高，反应特异性降低,出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性,使反应产物减少。②dNTP（底物）：等摩尔浓度的4种dNTP（即dATP、dTTP、dCTP和dGTP），终浓度一般为0.2mM（即饱和浓度），dNTP的浓度会影响扩增的产量、特异性和保真度。③引物(Primer)：1μM/L•上游引物：与目的序列5’端相同•下游引物：与目的序列3’端互补上游引物下游引物注：当双链解开成单链后，引物总是结合于靶序列的3’端。56④模板：单、双链DNA均可。模板的纯度要求不是很高，但其数量会直接影响扩增的效果。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。目前有两种TaqDNA聚合酶供应,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。⑤DNA聚合酶：最常用的是TaqDNA聚合酶，最适反应温度75℃。PfuDNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有3’-5’外切酶活性（高保真）的PCR酶，目前为止错配率最低的耐高温DNA聚合酶。谢谢！