一轮复习课件：选修生物技术实践模块

考纲解读1.微生物的实验室培养2.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数3.分解纤维素的微生物的分离4.细菌的结构和繁殖5.病毒的结构和增殖6.微生物需要的营养物质及功能7.培养基的配制原则8.培养基的种类考点1微生物的利用一、微生物的实验室培养（一）培养基人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长繁殖的营养基质称培养基一般的培养基均需要碳源、氮源、无机盐和水等培养基的基本成分液体培养基（一般用锥形瓶盛装）固体培养基（一般用试管或培养皿盛装），在液体培养基的基础上再添加琼脂。培养基的种类2、理解培养基的种类及应用（适当补充）按物理状态不同划分固体培养基液体培养基半固体培养基按化学组成不同划分：合成培养基/天然培养基按用途不同划分鉴别培养基选择培养基加入青霉素的培养基分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基分离金黄色葡萄球菌只有尿素作为惟一氮源的培养基分离出分解尿素的细菌不加氮源的无氮培养基分离固氮菌只有纤维素作为惟一碳源的培养基分离分解纤维素的细菌加入青霉素等抗生素的培养基分离导入了目的基因的受体细胞选择培养基做一些适当的补充（二）无菌技术无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法技术。获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，无菌技术就是防止杂菌污染的操作技术。灭菌方法适用对象所需条件灭菌时间灼烧灭菌接种金属用具、试管口、瓶口在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧直至烧红干热灭菌能耐高温并需要保持干燥的玻璃器皿、金属用具等干热灭菌箱内，160～170OC中1～2h高压蒸汽灭菌培养基、实验器具等100kPa，121OC15～30min消毒无菌技术的种类灭菌使用较为温和的方法（酒精、紫外线）来杀死部分对人体有害的微生物。对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁消毒；将培养皿、接种用具进行灭菌；接种的过程要在酒精灯附近进行。使用较为强烈的理化因素杀死物体内外的所有微生物（包括芽孢和孢子）。二、实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.牛肉膏蛋白胨固体培养基配方物质牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂水重量5g10g5g20g定溶至100mL2.基本过程：称量→溶化→灭菌→倒平板高压锅灭菌冷却到50OC左右时倒基本过程：称量→溶化→灭菌→倒平板分离分解尿素的细菌：培养基中加入尿素为唯一氮源分离分解纤维素的微生物：培养基中加入纤维素为唯一碳源（二）纯化大肠杆菌微生物接种方法常见的有平板划线法和稀释涂布平板法。1.平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面（操作如教材18页图示）。在数次划线后可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体称菌落。优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离缺点：不能计数一般用于分离微生物的纯种2.稀释涂布平板法将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操作和涂布平板操作。优点：可以计数，可以观察菌落特征。缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。一般用于平板培养基的回收率计数系列稀释操作101102103104105106(1)将分别盛有9mL水的试管灭菌并编号。(2)用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。(3)从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入第三支试管中，重复步骤2，直至到第六支试管。涂布平板操作(1)将涂布器浸在盛有70％的酒精的烧杯中。(2)取少量菌液（不超0.1mL），滴加到培养基表面。(3)将沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄后冷却8～10s。(4)用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。四、课题延伸—菌种的保存1.试管低温临时保存将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，培养成菌落后，置于4OC的冰箱中保存（每隔3～6个月要重新接种培养后再保存）。2.甘油管长期保存在3mL的甘油瓶中加入1mL的甘油，高压灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，充分混合后，置于－20OC的冷冻箱中保存。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（一）筛选菌株原理人为提供有利于目的菌株的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。1.在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是是什么物质？碳源是葡萄糖，氮源是尿素。2.分析该配方的培养基对微生物是否具有筛选作用？如果有，又是如何进行筛选的？能分解尿素的细菌的筛选阅读教材22页第一大段相关内容，并思考回答下列问题：有筛选作用，它的氮源只含有尿素，只有能合成分解尿素的脲酶的细菌才能生长。（二）统计菌落数目原理运用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数。统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30～300的平板进行计数。第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学设置了重复组，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否基本一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。阅读教材22页“（二）统计菌落数目”一段，并讨论教材中提出的问题。（三）设置对照A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同，二是由于培养基污染或培养基混有其它氮源。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实验方案有两种。一种方案是可以接种其它菌种，看是否有菌落的出现，验证培养基是否混有其它氮源。另一种方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。所以，在实验中一般都应设置对照组，使实验更有说服力。阅读教材22～23页“（三）设置对照”一段，并讨论教材中提出的问题。一、实验设计阅读教材23～25页“实验设计”和“操作提示”等两个内容，请根据教材提供的三个资料、样品的稀释和稀释液的取样培养流程示意图及“操作提示”的有关问题，自行设计一个《土壤中分解尿素的细菌的分离与计数》这样的一个实验。实验设计1.实验名称土壤中某样品细菌的分离与计数2.实验目的（略）3.材料用具（略）4.操作步骤从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去（铲已经过消毒处理）表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先消毒过的信封中。（1）土壤取样准备牛肉膏蛋白胨培养基（作为对照组）和选择培养基。将菌液稀释相同的倍数（见教材23页“样品稀释流程示意图”）。稀释倍数为103～107。每个稀释度均用3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基（都作好标记）。（2）制备培养基（3）高温消毒将准备好的培养基和8支试管、一支移液管（用纸包好）放到高压蒸汽灭菌锅内进行灭菌处理。将10g土样加入盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中（锥形瓶体积为250mL），充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛有9mL的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板。（4）微生物的培养与观察将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生如课本中图2-10的颜色反应。（5）细菌的计数选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。二、结果分析与评价1.培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。2.样品的稀释操作是否成功如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。3.重复组的结果是否一致如果各位同学选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，则需要从各项操作过程中去分析、寻找可能的原因。三、课题延伸能分解尿素的细菌的鉴定鉴定的原理：细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，会使培养基的pH升高。鉴定方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，利用此培养基进行细菌培养，观察培养基的颜色变化。分解纤维素的微生物的分离（一）纤维素与纤维素酶纤维素：一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，广泛地存在于植物的根、茎、叶等器官中。纤维素酶：由微生物分泌的一种复合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，由于它们的协同作用，最终将纤维素分解成葡萄糖。纤维素C1酶Cx酶纤维二糖葡萄糖苷酶葡萄糖①取二支20mL的试管实验：纤维素酶分解纤维素的实验②各加入一张滤纸条③各加入10mL0.1mol/L的醋酸－醋酸钠缓冲液甲乙④在甲试管中加入1mL蒸馏水，乙试管加入1mL纤维素酶⑤将试管放在140r/min的摇床上振荡1h⑥结果：乙试管的滤纸条消失讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？刚果红染色法刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。（二）纤维素分解菌的筛选用加入刚果红的纤维素培养基去培养微生物时，如果培养基中出现以菌落为中心的透明圈时，可说明该菌落是纤维素分解菌，因为它已将被刚果红染成红色的纤维素分解了。一、实验设计请你根据实验流程图和提供的三个资料以及“操作提示”，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的实验方案。土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布在鉴别纤维素分解菌的培养基上筛选产生透明圈的菌落阅读与思考阅读教材28～29页“资料一”～“资料三”，并思考相关问题。问题一：是液体培养基，因为没有添加琼脂。问题二：具有筛选作用，因为培养基中的碳源是纤维素，该培养基只有能分泌纤维素酶的纤维素分解菌才能生长。问题三：“资料三”中的两种方法各有哪些优点和不足，你打算选哪一种？土壤中纤维素分解菌的分离1.土样采集：土样采集的方法与本专题课题2类似。土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。二、实验案例2.选择培养：选择培养需要的仪器有：250mL锥形瓶、无菌称量瓶、药匙、1mL和10mL的移液管、天平、摇床、温度计等。在250mL锥形瓶中装入30mL选择培养基，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层包装纸，用线绳扎紧，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。选择培养的操作：称取土样20g，在无菌条件下加入装有30mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在30℃下振荡培养1～2d，至培养基变混浊，重复上述方法再培养一次，然后再进行梯度稀释和涂布平板。高考总复习·生物3.刚果红染色法分离：纤维素分解菌这一步所需要的仪器有：无菌培养皿、涂布器、1mL移液管，装有9mL无菌水的20mL大试管，温箱等。培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在500mL三角瓶中装入200mL培养基，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。倒平板操作：将灭菌后的固体培养基熔化，按无菌操作的要求，在无菌的培养皿中倒入15～20mL培养基，凝固后待用。涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0.