第三十九章-mRNA的翻译

第三十九章mRNA的翻译提纲一．参与翻译的主要生物大分子二．翻译的一般特征三．翻译的详细机制1.细菌的蛋白质合成2.真核生物的细胞质翻译系统3.细胞器翻译系统4.古菌的翻译系统四．mRNA的质量控制五．再次程序化的遗传解码六．翻译的抑制剂核糖体的分类与组成核糖体的主要功能定位1.A部位—氨酰tRNA结合部位，也称为受体部位；2.P部位—肽酰tRNA结合部位；3.E部位—空载tRNA临时结合的部位；4.肽酰转移酶活性部位——催化肽键形成的部位；5.mRNA结合部位；6.多肽链离开通道——正在延伸的多肽链离开核糖体的通道；7.一些可溶性蛋白质因子（起始因子、延伸因子和终止因子）的结合部位。核糖体的三维结构模型和主要的功能部位细菌核糖体的各种功能部位细菌核糖体的各种功能部位真核细胞多聚核糖体的结构细菌多顺反子mRNA和真核生物单顺反子mRNA的翻译tRNA的结构与功能二级结构与三级结构同工受体tRNA-携带同种氨基酸的不同tRNA个性-“第二套遗传密码”某些特殊的tRNAs1.起始tRNA:tRNAfMet和tRNAiMet2.校正tRNA3.tmRNA常见的tRNA的个性（大肠杆菌）tRNA个性丙氨酸丝氨酸缬氨酸谷氨酰胺苯丙氨酸异亮氨酸蛋氨酸受体茎中的G3:U70碱基对受体茎中G1:C72、G2:C71、A3:U70碱基对,D茎中的C11:G24碱基对反密码子反密码子,特别是其中的U反密码子,D环中的G20,3′端的A73U35反密码子一种人工合成的保留有G3:U70的微螺旋仍能携带Ala氨酰-tRNA合成酶（aaRS）两步反应机制：1.ATP+氨基酸(AA)--AA-AMP+PPi2.tRNA+AMP-AA--AA-tRNA+AMP分类1.第一类aaRS2.第二类IIaaRS校对机制-在装载氨基酸水平的质量控制1.aaRS是对氨基酸“身份”进行检查唯一的场所2.核糖体不在乎哪一种氨基酸与tRNA相连3.实载的tRNA被修饰后仍然能起作用4.装载前和装载后编辑5.双筛机制两类氨酰-tRNA合成酶的催化机理两类aaRS第一是单体酶，含有一个平行β-折叠核心和由两段同源的氨基酸一致序列HIGH和KMSKS组成的Rossman折叠，该结构模体参与ATP的结合和酶的催化。此类aaRS识别的tRNA个性通常包括反密码子环内的核苷酸残基和受体茎，一般在受体茎小沟一侧与tRNA结合，紧握反密码子环，将tRNA接受氨基酸的一端置于活性中心，最后总是先将氨基酸转移到tRNA3′端腺苷酸的2′-OH上，然后再通过转酯反应转移到3′-OH。由此类酶催化的氨基酸有Arg、Cys、Gln、Glu、Ile、Leu、Met、Trp、Tyr和Val。第二类通常为寡聚酶，具有另外的保守序列，由它们形成三种首尾相连的同源结构基序，其中第一种参与二聚体的形成，另一种是“签名”模体，由7段反平行的β折叠、3段相邻的α-螺旋和一种不多见的负责结合核苷酸的折叠组成，由它和第三种结构基序一起组成了酶活性中心的核心部分。这些酶结合tRNA分子的另一面（受体茎大沟一侧），识别的个性不包括反密码子环，最后总是将氨基酸转移到tRNA3'-端腺苷酸的3′-OH上（苯丙氨酰-tRNA除外）。由此类酶催化的氨基酸有Ala、Asn、Gly、Asp、His、Lys、Phe、Pro、Ser和Thr。aaRS的校对机制装载前编辑1.有时aaRS激活错误的氨基酸2.正确的tRNA与酶的结合诱导aa-AMP的水解，而不是装载3.aa-AMP被转移到酶的编辑中心而水解装载后编辑1.有时aaRS激活错误的氨基酸，并将其转移到tRNA上2.错误的aa-tRNA在被释放之前被转移到酶的编辑中心水解双筛机制1.难以建立完美的活性中心2.活性中心和编辑中心层层把关，排除错误的氨基酸使用双筛机制的实例-IleRS一筛：酶活性中心优先结合正确的同源氨基酸，体积比同源氨基酸大的因为无法进入活性中心首先被排除；二筛：酶的编辑中心对错误的非同源氨基酸进行编辑，大小合适小的误载的氨酰-AMP或氨酰-tRNA在校对中心被水解“出局”。以IleRS为例，如果Val进入它的活性中心，并发生了第一步反应，生成Val-AMP，但Val-AMP会被送入编辑中心进行编辑，水解误载的Val。由于aaRS具有内在的校对机制，因此在细胞内形成误载的氨酰-tRNA的可能性非常低。氨酰-tRNA合成酶的双筛机制辅助蛋白因子蛋白质合成的每一步都需要一些特殊的可溶性的蛋白质因子的参与，包括起始因子（IF）、延伸因子（EF）、释放因子（RF）和核糖体循环因子（RRF），它们分别参与肽链合成的起始、延伸、肽链释放和核糖体循环。其中的某些蛋白质因子为小G蛋白。细菌参与翻译的起始因子、延伸因子和终止因子的结构与功能真核生物参与翻译的起始因子、延伸因子和终止因子的结构与功能蛋白质生物合成的一般特征1.mRNA、tRNA和核糖体起相同的作用2.翻译的极性：阅读mRNA的方向都是从5′端→3′端，多肽链生长的方向总是从N-端→C-端。3.三联体密码4.正确的氨基酸的参入取决于mRNA上的密码子与tRNA上的反密码子之间的相互作用，与tRNA所携带的氨基酸无关5.密码子与反密码子的相互识别遵守摆动规则6.在核糖体上同源tRNA的识别是诱导契合的过程兔网质红细胞[3H]-Leu在不同的时段完成标记纯化全长的多肽降低温度以降低翻译的速率证明多肽链生长的方向总是从N-端→C-端的实验使用胰蛋白酶消化，分离肽段，用放射性对肽端位置作图在保温60分钟后分离出的α珠蛋白几乎所有的Leu残基都是带放射性的。而在保温仅几分钟后分离到的α珠蛋白，其带放射性的Leu则集中在肽链的C端实验(1962)：证明正确的氨基酸的参入与tRNA所携带的氨基酸无关tRNACys-ACA反密码子(识别编码Cys的UGU密码子)无细胞抽取物,氨基酸,aaRSCys-tRNACys-ACA蛋白质含有CysRNA模板UGUGUGUGUG...使用金属镍催化剂，去除巯基Ala-tRNACys-ACARNA模板UGUGUGUGUG...蛋白质含有Ala遗传密码的破译MarshallNirenberg和HeinrichMatthaei建立了大肠杆菌无细胞翻译系统无细胞抽取物•核糖体•各种tRNA•氨基酸•aaRS•ATP,GTP+mRNA=蛋白质他们使用多聚核苷酸磷酸化酶得到同聚物破译第一个遗传密码在1961年，Matthaei发现，当将PolyU加到大肠杆菌无细胞翻译系统中以后，一种仅由苯丙氨酸组成的多肽即多聚苯丙氨酸被合成了，这就意味着他们成功破译出第一个密码子即UUU的密码子。即：nNDPs→(NMP)n+nPi破译其余的遗传密码在1964年，由Nirenberg发明的核糖体结合技术使得遗传密码最终完全得以破译。该技术是基于两个基本事实：一是人工合成的三聚核苷酸可以作为模板；二是在无GTP时，三聚核苷酸可以促进同源的氨酰-tRNA结合在核糖体上，而不生成蛋白质。这样，利用由核糖体和三聚核苷酸及其同源的氨酰-tRNA形成的三元复合物能被硝酸纤维素滤膜吸附的性质，可将结合的氨酰-tRNA与其他没有结合的氨酰-tRNA分开。通过分析结合在硝酸纤维素滤膜上的氨酰-tRNA的氨基酸性质和原来的三聚核苷酸序列可以弄清某种氨基酸的密码子。19AAs+[14C]-Pro+aaRSs核糖体结合技术使用NC滤膜过滤放射性在滤出液19AAs+[14C]-Phe+aaRSs使用NC滤膜过滤放射性留在滤膜上标准的遗传密码表遗传密码的主要性质1.简并与兼职2.密码子的选定不是随机的3.通用和例外4.不重叠5.无标点6.同一种氨基酸的不同密码子使用的频率不尽相同线粒体内遗传密码的例外摆动规则摆动规则由Crick于1966年提出，用来解释一种tRNA反密码子如何能够识别一种氨基酸的几个同义密码子以及某些含有稀有碱基（如次黄嘌呤）的反密码子是怎样识别由正常碱基构成的密码子的现象。该规则的内容是：密码子在与反密码子之间进行碱基配对的时候，前两对碱基严格遵守标准的碱基配对规则，第三对碱基则具有一定的自由度。但并非任何碱基之间都可以配对，当反密码子第一位碱基是A或C者，只能识别一种密码子；第一位碱基是G或U者，则能识别两种密码子；第一位碱基是I者，则能识别三种密码子。摆动规则的意义在于使得在翻译的过程中，tRNA和mRNA更容易分离。摆动规则反密码子第一个碱基密码子第三个碱基ACGUIUGC、UA、GA、C、U在核糖体上同源tRNA的识别是诱导契合的过程以细菌为例，在A部位上同源tRNA与mRNA的结合诱导A1492和A1493从16SrRNA螺旋44的内部环中被挤出来，同时还造成通用保守的G530从原来的顺式构象编成反式构象。在新的构象之中，A1493和A1492分别与密码子/反密码子的前两个碱基对螺旋相互作用，而G530同时与反密码子的第二个位置和密码子的第三个位置相互作用。这些构象诱导变化的结果是密码子/反密码子的前两个碱校对受到核糖体的检查，以区分正确的Watson-Crick碱基对和错配的碱基对，而“摇摆”位置似乎能够容忍摆动规则允许的碱基对。大肠杆菌在翻译的五个阶段所必需的主要成分翻译的详细机制4步骤反应：1.氨基酸的活化2.起始3.延伸4.终止和释放细菌的蛋白质合成氨基酸的活化1.fMet-tRNAfMet的形成2.其他氨酰-tRNA的形成起始阶段1.起始密码子的识别2.起始复合物的形成延伸阶段：在起始复合物形成以后，翻译即进入延伸阶段，延伸阶段所发生的主要事件是进位、转肽和移位且不断的循环。多肽链合成的终止与释放起始密码子的识别细菌翻译系统起始密码子的识别主要是依赖于mRNA5′端的SD序列与16SrRNA3′端的反SD序列之间的互补配对。SD序列位于起始密码子上游约7个碱基的区域，由4~5个碱基组成，富含嘌呤碱基，它是由JohnShine和LynnDalgarno在1974年，通过比较多种原核细胞蛋白质mRNA的5′端核苷酸序列之后总结出来的。在16SrRNA3′端有一段富含嘧啶碱基的序列，可以和SD序列互补配对，因而被称为反SD序列。许多实验证明，正是SD序列与反SD序列的互补关系，才使得位于mRNA的SD序列下游的第一个AUG用作起始密码子。SD序列和反SD序列起始复合物的形成起始复合物的形成与起始密码子的识别紧密联系在一起，起始阶段的总反应式可写成：30S+50S+mRNA+fMet-tRNAfMet+IF1+IF2+IF3+GTP→[70S·mRNA·fMet-tRNAfMet]+GDP+Pi+IF1+IF2+IF3在形成的三元复合物中，起始密码子正好处于P部位，而fMet-tRNAfMet通过密码子与反密码子的互补作用定位于P部位，A部位是空着的，mRNA像一根细线一样，通过小亚基上弯曲的通道，将作为模板进行翻译。无活性的70S核糖体SD序列30S起始复合物70S起始复合物GDP+Pi多肽链合成的延伸每添加一个氨基酸需要三步反应——进位、转肽和移位三步反应循环多次，循环的次数取决于mRNA上的密码子的数目原核生物和真核生物在延伸循环上非常相似快：15-20个氨基酸/秒精确：每参入~10000氨基酸出现1个错误进位转肽移位重复多肽链合成的延伸进位进位是指正确的氨酰-tRNA进入A部位，它是在EF-Tu·GTP的帮助下完成的。进位的具体过程是：首先EF-Tu·GTP和fMet-tRNAfMet以外的氨酰-tRNA形成三元复合物，随后三元复合物进入A部位；氨酰-tRNA的结合导致小亚基的构象发生变化，致使16SrRNA上一段高度保守的碱基与密码子/反密码子复合物前两个碱基对上的小沟能够紧密地发生作用，有利于确保正确的tRNA的结合。如果上述相互作用没有能够稳定特定的核糖体构象，进入A部位的错误氨酰-tRNA在肽键形成之前被释放。核糖体上的一个结构域充当EF-Tu的GAP，该功能依赖于密码子/反密码子的相互识别而使得进入的氨酰