5.3血红蛋白的分离和提取-(公开课)

1．下列有关固定化技术的叙述中，错误的是（）A，加洗衣粉是将固定化酶加入洗衣粉中制作而成的B，化学结合法比包埋法更有利于底物与酶的接触C．10％的葡萄溶液为固定化酵母细胞提供能源物质并维持透压D．与固定化酶相比，固定化细胞操作更简便，成本低吸附在载体表面复习A2、下列关于固定化细胞与固定化酶的使用的叙述，正确的是A．从酶的固定方式看，吸附法比化学结合法对活性影响大B．尿糖试纸含有固定化的葡萄糖酶和过氧化氢酶，可以反复使用C．作为消化酶使用时，蛋白制剂以口服方式给药D．将海藻酸钠凝胶珠用自来水冲洗，目的是洗去CaCl2和杂菌复习C•3．某同学欲通过制备固定化酵母细胞进行葡萄糖溶液发酵实验，图1表示制备固定化酵母细胞的有关操作，图2是进行葡萄糖发醇的装置（a是固定化酵母细胞，b是反应柱，c是分布着小孔的筛板），下列叙述正确的是（）•A．刚溶化的海藻钠应迅速与活化的母混合制各混合液•B，利用固定化母细胞进行发酵，糖类的作用仅是作为反应底物•C．图1中X溶液为CaCl2溶液，将与酵母细胞混匀的海藻酸钠溶液迅速注入CaCl2溶液，会观察到有凝胶珠形成•D．图2装置中的长导管主要是排出CO2，防止空气中的杂菌进入反D•4下列有关固定化酶和固定化细胞的说法正确的是()•A．某种固定化酶的优势在于能催化一系列生化反应•B．固定化细胞技术一次只能固定一种酶•C．国定化酶和固定化细胞的共同点是所固定的酶都可在细胞外起作用•D．固定化酶和固定化细胞都能反复使用，但酶的活性迅速下降c辅导书53页右上，重点记忆直接使用酶固定化酶固定化细胞优点缺点催化效率高，低耗能、低污染等。酶既能与反应物接触，又能与产物分离，酶还可以被反复利用。成本低，操作更容易，产生一系列酶。1、对环境条件非常敏感，容易失活；2、溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；3、反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量。不利于催化一系列的酶促反应可能造成酶的部分失活，酶活力有损失。固定后的酶或细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降等提取的原理：色素可以溶解在有机溶剂中分离的原理：不同色素在有机溶剂中的溶解度不同因为不同色素在有机溶剂中的溶解度不同，所以在层析液中溶解度大的，随层析液上升快，所以四种色素会分开。纸层析法又称纸色谱法，是用纸作为载体的一种色谱法，依据极性相似相溶原理，是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂作为流动相。由于样品中各物质分配系数不同，因而扩散速度不同，从而达到分离的目的。。•37．[生物——选修1：生物技术实践]（15分）•淀粉填充聚乙烯类塑料（淀粉—PE）是一种聚乙烯类塑料替代材料，科研人员开展相关研究，从垃圾堆埋场中筛选到能够更高效降解淀粉—PE的菌株。回答下列问题：•（1）科研人员从垃圾堆埋场的土样中筛选分离该菌株的原因是。•（2）在进行该菌株的分离筛选时，需将适宜稀释倍数的土壤溶液接种在以为碳源的液体培养基上，进行为期5天的富集培养；进一步分离纯化该微生物应采用的接种方法是。•（3）研究发现，该菌株能降解淀粉—PE可能是分泌了酶和酶。研究人员提纯相应的酶需用到凝胶色谱法，该方法是根据分离蛋白质。•（4）若要了解相应的酶的最适温度，请设计实验加以探究（针对一种酶写出实验思路即可）。该菌分布在富含淀粉—PE的环境中的可能性较高，而垃圾堆埋场里含有较多的淀粉—PE淀粉—PE稀释涂布平板法（平板划线法）淀粉降解PE的蛋白质的相对分子质量设置一系列的温度梯度，其他条件相同且适宜，将淀粉（降解PE的）酶和淀粉液（PE）分组，在各温度下分别保温，将相同温度条件下的进行混合，一段时间后，用一定方法检测各组中底物的消耗量或产物的生成量（3分）一、基础知识：（一）蛋白质分离原理（二）蛋白质分离的方法1）凝胶色谱法：又称分配色谱法2）电泳法（三）缓冲液的作用课题3血红蛋白的提取和分离学习目标：了解分离生物大分子的基本原理二、实验操作－－实验步骤血液组成成分（1）洗涤红细胞（2）释放血红蛋白（3）分离血红蛋白（4）透析血红蛋白1、样品处理3、纯化4、纯度鉴定2、粗分离SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度凝胶色谱法进行纯化注意事项一、分离蛋白质的原理与方法分离蛋白质的原理蛋白质特性的差异分子的所带的性质和多少溶解度吸附性质对其他分子的形状、大小电荷亲和力分离蛋白质的方法(1)凝胶色谱法：①概念：根据________分离蛋白质的有效方法，也叫________。②过程及原理：a．凝胶形态：微小的组成：大多数由构成结构：内部有许多相对分子质量的大小分配色谱法多孔的球体多糖类化合物贯穿的通道3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快总结：大分子经过路程短，流动快；小分子经过路程长，流动慢。洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子4、具体过程凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示凝胶色谱法样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出不同时间进行收集下图中，可表示为相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的移动过程的是()B1．用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的蛋白质()A．路程较长，移动速度较慢B．路程较长，移动速度较快C．路程较短，移动速度较慢D．路程较短，移动速度较快D(2)电泳法：①电泳的概念：指________在电场的作用下发生迁移的过程。②原理：利用了待分离样品中各种分子的________、________以及形状的不同，使带电分子在电场中产生不同的________，从而分离样品中的各种分子。③分离方法：________、________等。其中后者使用时通常加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于________。带电粒子带电性质分子大小迁移速度琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳分子大小影响蛋白质分子运动速度的因素决定运动方向决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小√√√√在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图练习．下列各项中不属于电泳使样品中各分子分离的原因的是()A．分子带电性质的差异B．分子的大小C．分子的形状D．分子的变性温度D幻灯片20由弱酸和相应的强碱盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等缓冲溶液－－洗脱剂（1）作用：（2）配制：抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。（3）在血红蛋白的提取和分离实验中用的缓冲液的原因？目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能。血液组成成分阅读思考：1.血液由______和________两部分组成。2.血细胞中________细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是_____________。3.该化合物是由_____________和____________构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的______________________基团。血浆血细胞红细胞血红蛋白2条α-肽链2条β-肽链亚铁血红素1.洗涤红细胞阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么？洗涤干净的标志是什么？血液100mL3g柠檬酸钠低速短时间离心红细胞血浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色去除杂质重复离心，吸出黄色血浆上清液中没有黄色2.释放血红蛋白阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质，有什么用？目的分析：1.蒸馏水的作用是______________________________。2.加入甲苯的作用是____________________________。3.充分搅拌的目的是____________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂滤纸过滤脂类物质3.分离血红蛋白分离过程红细胞混合液高速离心10min离心管烧杯有机溶剂血红蛋白②试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。3.分离血红蛋白③分离：滤纸过滤：除去脂溶性沉淀层，分液漏斗中静置：分出下层的红色透明液体。20mmol/L磷酸缓冲液4.透析血红蛋白透析的目的是什么？1mL1mL1mL去除血红蛋白中的小分子杂质①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12h纯化－－凝胶色谱法1.凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：教材图5－193.样品的加入和洗脱注意：（1）凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀；凝胶装填时尽量紧密；装填时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。（2）装完后，立即用缓冲液洗涤，使凝胶装填紧密3.样品的加入和洗脱1.调液面2.加样4.洗脱5.收集缓冲液凝胶注意：洗脱过程不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。3.再调液面1.调液面2.加样3.再调液面4.洗脱、5.收集注意事项1.红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2.凝胶的预处理：沸水浴法，还能除去微生物和气泡3.色谱柱的装填：装填尽量紧密；无气泡；洗脱液不能断流。4.色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。知识总结血红蛋白的提取和分离蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定1、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是A、相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B、相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C、相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D、二者根本无法比较练习巩固2.相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个B3.凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是()A.改变蛋白质分子通过凝胶时的路径B.吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度C.将酶或细胞固定在凝胶中D.与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度4.在利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要加入缓冲液，其作用主要是()A.使酶的活性最高B.使蛋白质的活性最高C.维持蛋白质所带的电荷D.使蛋白质带上电荷AC5、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差异6.下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（）•A．可采集猪血作为实验材料B．用蒸馏水重复洗涤红细胞•C．血红蛋白释放后应低速短时间离心D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液A8.在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果B、气泡阻碍蛋白质的运动C、气泡与蛋白质发生化学反应D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密9.样品的加入和洗脱的操作不正确的是A、加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面B、加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内C、等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D、用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面