一种可绝对定量核酸的数字PCR微流控芯片

Vol.34高等学校化学学报No.32013年3月摇摇摇摇摇摇CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES摇摇摇摇摇摇545~550摇摇doi:10.7503/cjcu20120902一种可绝对定量核酸的数字PCR微流控芯片朱强远,杨文秀,高一博,于丙文,邱摇琳,周摇超,金摇伟,金钦汉,牟摇颖(浙江大学工业控制技术国家重点实验室,智能系统与控制研究所,分析仪器研究中心,杭州310058)摘要摇构建了一种新型的可进行核酸单分子扩增和核酸绝对定量的数字聚合酶链式反应(数字PCR)微流控芯片.应用多层软光刻技术,以聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为芯片材料,盖玻片作为基底制作了具有3层结构以及微阀控制功能的微流控芯片.芯片的大小与载玻片相当,可同时检测4个样品,每个样品通入芯片后平均分配到640个反应小室,每个小室的体积为6nL.以从肺癌细胞A549中提取的18sRNA为样品检测了该芯片的可行性.将样品稀释数倍后通入芯片,核酸分子随机分布在640个小室中并扩增.核酸分子在芯片中的分布符合泊松分布原理,当样品中待测核酸分子平均拷贝数低于0郾5个/小室时,则每个反应小室包含0个或1个分子.经过PCR扩增后,有模板分子的小室检测结果为阳性反应,而无模板分子的小室为阴性反应,最后通过计数阳性反应室的个数,可绝对定量原始待测样品中的目标DNA分子拷贝数.实验结果表明,该数字PCR芯片可实现DNA单分子反应和核酸绝对定量,具有成本低、灵敏度高、节省时间和试剂以及操作简单等优点,为数字PCR方法在普通实验室的应用提供了一种新途径,可用于癌症及感染性疾病的早期诊断、单细胞分析、产前诊断以及各种细菌病毒的核酸检验等研究.关键词摇数字聚合酶链式反应;微流控芯片;单分子扩增;核酸定量;绝对定量中图分类号摇O657摇摇摇摇文献标志码摇A摇摇摇摇收稿日期:2012鄄09鄄29.基金项目:国家自然科学基金(批准号:31070772,31270907)和教育部博士学科点基金(批准号:20090101110136)资助.联系人简介:牟摇颖,女,博士,教授,博士生导师,主要从事生命科学新技术、新仪器研究.E鄄mail:[e-mail]核酸扩增和定量一直是分子生物学领域的核心技术之一,已应用到分子测序、基因表达分析、基因突变研究、疾病早期分子诊断、单核苷酸多态性和药物筛选等研究领域,并起到重要作用.尤其是在癌症以及病原传染病等疾病的早期分子诊断研究中,以核酸扩增为基础的核酸定量检测技术,因其分析速度快、灵敏度高、高通量及诊断时间短的显著优点,成为疾病早期诊断的主要应用技术之一,具有广阔的发展空间.目前,应用最多、灵敏度最高的核酸定量技术是实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR),其准确度可达95%,检测时将未知的目标核酸分子和已知标准样品同时进行扩增,根据加入的荧光分子探针信号实时观察模板的扩增情况,检测结果以线性的扩增信号形式输出,根据已知标准样品的扩增曲线来推算未知样品的起始模板拷贝量.因此,荧光定量PCR技术是一种相对的核酸定量方法,其灵敏度和准确度均受到限制.上世纪90年代,Vogelstein等[1]提出了一种新的核酸定量方法数字聚合酶链式反应(数字PCR)技术,解决了这一技术难题.数字PCR技术的原理是根据泊松分布公式将起始待测模板细分为很多小份,使每1份中至多分配到1个核酸分子,在每个小份中进行单个拷贝核酸分子PCR扩增反应,最后计数有扩增反应的小份的数量即可确定目标模板的拷贝数.这种核酸定量方法实现了对单个DNA分子的扩增反应和检测,对于每个模板DNA分子的反应结果,以阳性为“1冶、阴性为“0冶直接计数,以计数结果计算出模板DNA分子的拷贝数,因此数字PCR技术是一种对待测核酸分子进行绝对定量的方法[2],其灵敏度非常高,且只需要很少的模板量,尤其适用于痕量、不易得到的待测样品.因此,数字PCR技术非常适合用于疾病的早期诊断.以微电子技术为基础的微流控芯片加工技术的发展为数字PCR技术提供了合适的平台,微流控芯片的微型化、集成化、迅速高效、所需试剂和样品量少以及适于现场检测等优点使数字PCR技术具有更大的发展空间.迄今,已有报道的数字PCR平台有微反应室阵列芯片[3]、微液滴和微乳滴[4]、离心式磁盘[5]、滑动式芯片[6]和集成流路芯片[7]等,其中集成流路(Integratedfluidiccircuit,IFC)芯片技术和微液滴芯片技术等已经实现商品化.但这些技术存在芯片制作复杂、操作繁琐且需要特殊的流体控制系统等缺点,使其商品化的产品成本过高,仪器庞大繁冗且操作复杂,不利于产品的普及.因此,迫切需要发展新型、简单、便携式的数字PCR芯片.本文采用Quake等[7]开发的IFC芯片中的微阀技术,以普通盖玻片为基底,用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料制作了一种可进行数字PCR反应的微流控芯片,该芯片操作简便、价格低廉,并兼具微阵列芯片高通量的特性,具有省时、省力、省试剂的优点,应用领域广泛.以从肺癌细胞A549中提取的18sRNA作为模板,在该芯片上实现了数字PCR反应,并对样品进行了精确的定量检测,为该芯片在生命科学领域的广泛应用奠定基础.1摇实验部分1.1摇试剂与仪器AxyPrepTMMultisourceTotalRNAMiniprepKit(美国AxygenBiosciences公司);EASYDilution(日本TaKaRa公司);A549肺癌细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心);SU8鄄2075负性光胶(MicroChem.Corp.),PDMS(美国DowCorning公司).MGL96G型PCR仪(杭州朗基科学仪器有限公司);MaestroExIN鄄VIVOIMAGINGSYSTEM荧光成像仪(美国CRIMaestro公司);IX71型荧光倒置显微镜(日本Olympus公司).1.2摇数字PCR微流控芯片的设计与制作采用多层软光刻技术制作芯片模具.首先用CorelDRAW软件设计芯片通道图样,然后用高分辨率打印机打印到透明胶片上成为掩膜,芯片图样见图1(A).微流控芯片包括2层PDMS和作为底层的盖玻片,构成流动层和控制层.流动层模具制作:首先在经六甲基二硅氮烷(HDMS)预处理的干净硅片上旋转涂覆AZ4620正性光胶,于110益烘烤20min固定,然后覆盖上微通道图样的掩膜,在曝光机下曝光,显影后再次于200益烘烤60min固定,制得的微通道高度约为12滋m.将SU8鄄2075负性光胶旋转涂覆到制得的微通道模具上,烘烤固定后覆盖微反应室图样的掩膜,并将微反应室和微通道校准,使其列为一条直线,曝光显影后烘烤固定,制得的微反应室高度约为150滋m.控制层模具采用SU8鄄2075负性光胶以同上方法制作,制得的控制通道高度约为25滋m.Fig.1摇Maskofmicrofluidicchip(A)andthree鄄dimensionaldrawingofmicrowellsandchannelsintheflowchannelmold(B)摇摇Thehorizontalaxisiscontrolchannelswithaheightof25滋mandwidthof150滋m.Verticalaxisistheflowlayercomposedoftheconnectedchannelandmocrowells.Thechanneliswithaheightof12滋mandwidthof150滋m.Themicrowelliscuboidwithaheightof150滋mandasquaresidewhichthelengthis200滋m.按PDMS单体(A)颐PDMS固化剂(B)质量比为30颐1制备PDMS预聚合物,抽真空除去空气后,旋转涂覆到控制层模具上,其厚度为40滋m,然后置于80益热板上使其凝固.配制A颐B质量比为5颐1的PDMS预聚合物,慢慢倾倒在流动层模具上,厚度为4mm,于80益烘烤40min,将PDMS层从模具上剥下来,打孔,然后将流动层PDMS覆到控制层PDMS上,于80益烘烤1郾5h黏合.在烘烤黏合前,校准流动层微通道与控制层微通道,使其交叉成十字形(见图1).待2层PDMS黏合后从控制层模具上剥下来打孔,将盖玻片与控制层PDMS用等离子体处理,然后黏合在一起于80益下烘烤4h固定.最后,在PDMS打孔处连接上内径为0郾5mm的聚四氟乙烯管,制成3层结构的微流控芯片.芯片通道645高等学校化学学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇Vol.34摇结构尺寸见图1(B).1.3摇数字PCR芯片进样将2伊106个A549细胞制成悬浮液,用AxyPrepTMMultisourceTotalRNAMiniprepKit提取总RNA.提取的RNA用分光光度仪和凝胶电泳分析其质量,然后逆转录合成cDNA分子.将合成的cDNA溶液用EASYDilution以连续倍数稀释成梯度浓度的溶液,作为数字PCR反应的模板.数字PCR反应体系含10滋L2伊TaqMan襅GeneExpressionMasterMix(AppliedBiosystems),1滋L20伊TaqMan襅GeneExpressionAssay(AppliedBiosystems,18sRNA),6滋LRNase鄄free水,1滋L连续稀释的模板(cDNA)和2滋L缓冲液[8][0郾25滋g/滋L牛血清蛋白(BSA)+0郾001%(质量分数)Gelatin+0郾025%(质量分数)TritonX鄄100],总体积为20滋L.阴性对照组以无RNase水代替cDNA模板.将配好的PCR反应液用注射器通过连接芯片的聚乙烯管注入微流控芯片的反应通道中,反应通道注满后,向芯片控制通道中注入二次蒸馏水.将控制通道出水孔端的聚乙烯管封闭,在注射泵的作用下,利用水压和PDMS薄膜的弹性在控制通道和反应通道间形成具有微阀功能的凸起,将反应通道中的所有微反应室分别封闭,形成有独立空间的平行PCR反应室.最后,封闭进样孔和出样孔,将控制通道的进水孔连接注射泵,通过注射泵保持控制通道水压的稳定.1.4摇数字PCR反应和终点检测数字PCR反应程序:50益预热2min,95益预变性10min,95益变性10s,60益退火延伸60s,进行40个循环.反应结束后,用荧光成像仪或荧光倒置显微镜分别检测反应结果,成像结果通过CCD图像传感器在计算机上保存,用图像处理软件分析,计数阳性反应小室的数目,从而得到初始模板的分子数目.2摇结果与讨论2.1摇数字PCR微流控芯片制得的微流控芯片(图2)大小与载玻片相等,厚约4mm,4个独立的反应区可同时进行4个独立Fig.2摇PhotographoftheprototypedeviceThedeviceiscomposedoftwolayersofsiliconerubber(PDMS),acontrollayerandaflowlayercontaininghundredsofmicrowells,bondingonaglasscoverslip(0郾17mm).Thesizeofthechipis50mm伊24mm伊4mm.反应.每个反应区的进样口和出样口以及控制层的进水口和出水口均设计在芯片的两端,可用细导管相连.芯片采用PDMS和玻璃材料,透光性良好.每个微反应室的体积为6nL,每个反应区有640个微反应室,可容纳约4滋L的反应液.反应区中微反应室的体积和数量会直接影响数字PCR终点结果的精确性和准确性,因此在一定的技术条件下,可尽量降低微反应室的体积,增加反应区的微反应室的数量.2.2摇芯片进样与平行样控制研究微流控芯片的功能与通道的设计及其结构有关,该芯片具有3层,上层是承载微反应室和微通道的厚PDMS层,底层是厚170滋m的玻璃盖片,中间是承载控制通道的薄PDMS层.通道结构和微阀如图3所示,微反应室由微通道前后相连,进样时反应液沿着微通道将微反应室充满[见图3(A)];控制通道在反应通