阪崎肠杆菌研究进展

中国检验检疫科学研究院食品安全研究所阪崎肠杆菌研究进展中国检验检疫科学研究院食品安全研究所赵贵明2009年8月中国检验检疫科学研究院食品安全研究所内容提要•第一部分：阪崎肠杆菌的分类学变化•第二部分：阪崎肠杆菌检验研究进展中国检验检疫科学研究院食品安全研究所阪崎肠杆菌的重视程度•《CODEOFHYGIENICPRACTICEFORPOWDEREDFORMULAEFORINFANTSANDYOUNGCHILDREN》CAC/RCP66-2008替代CAC/RCP21-1979–由争论到定论–给出了制定阪崎肠杆菌监控计划的指南脑膜炎小肠结肠炎菌血症中国检验检疫科学研究院食品安全研究所我国对阪崎肠杆菌方面的管理规定•《关于对进口乳制品进行阪崎肠杆菌检测的通知》(国质检食函[2005]690号)；•《关于加强进口乳制品检验检疫监督管理工作的通知》国质检食函[2007]298号）；•《婴幼儿配方乳粉生产许可证审查细则》(2006、2008版)中国检验检疫科学研究院食品安全研究所阪崎肠杆菌对配方粉的污染点、存活时间和传播线路•监控时间：2005.4—2006.3•分离出阪崎肠杆菌：80株•中间产品和终产品的阳性检出率：2.5%•阳性样品检出点占全部取样点的比例：31%中国检验检疫科学研究院食品安全研究所第一部分：阪崎肠杆菌的分类学变化•阪崎肠杆菌分类学及命名的发展历史–阪崎肠杆菌的发现及其命名历史–阪崎肠杆菌为新种的分类依据•克罗诺杆菌分类学、词源学及其属和种生物学特性–克罗诺杆菌（Cronobacterspp.）属名、种名词源学–属及其各个种的生物学特性、代表性种中国检验检疫科学研究院食品安全研究所阪崎肠杆菌分类学及命名的发展历史•阪崎肠杆菌的发现及其命名历史–1929年Pangalos报道的一种引起婴儿败血症的产黄色素的大肠菌，称为“黄色大肠菌、黄色肠杆菌”;–1961年Urmenyi和Franklin根据1958年发生在英国奥尔本的两例新生儿死亡病理研究，在报道中描述了其病因源于一种少见的产黄色素的阴沟肠杆菌菌群，并取日本细菌学家RiichiSakazaki的名字作为该菌的名称;有人称之为：“Urmenyi和Franklin杆菌”；–1965年Joker等分析了发生在丹麦的一个相同病例，并报道该种菌可导致新生儿脑膜炎并产生神经损伤，根据两起报道首次明确了该种病原菌为“非典型的产黄色素的阴沟肠杆菌”.–直到1980年，Farmer等发表了题为“Enterobactersakazakii,newspeciesofEnterobacteriaceaeisolatedfromclinicalspecimens.”的文章，该菌才被统一命名并定义，该篇文章是对阪崎肠杆菌研究的阶段性成果总结。阴沟肠杆菌阪崎肠杆菌中国检验检疫科学研究院食品安全研究所•阪崎肠杆菌为新种的分类依据–统一了该菌的名称；–确证了“产黄色素的阴沟肠杆菌”是一个新种，而不是阴沟肠杆菌的一个生物群。依据什么？DNA相关性产黄色素生化试验抗生素易感性细菌不同株属于同一种水平DNA的相关性通常应在70%或更高中国检验检疫科学研究院食品安全研究所DNA相关性实验ATCC29544阴沟肠杆菌差异柠檬酸杆菌51%51%中国检验检疫科学研究院食品安全研究所生化试验•不利用山梨醇•36C下培养7d，DNA酶为阳性中国检验检疫科学研究院食品安全研究所Farmer实验结论•阪崎肠杆菌与阴沟肠杆菌不是同一个种；•阪崎肠杆菌生化反应与肠杆菌属细菌更为相近；•阪崎肠杆菌应作为一个独立种，归属于肠杆菌属，鉴于所分离出的阪崎肠杆菌之间也有差异，被分成15个生物型或群。中国检验检疫科学研究院食品安全研究所细菌分类方面的问题•种是生物分类中基本分类单位，是具有高度特征相似性的菌株群，该菌株群与其它类群的菌株有很明显的区别；•细菌学家和分类学家存在一定分歧；•DNA杂交同源性在60-70%以上，或16SrRNA序列同源性达到97%以上的菌株，被认为是同一种。中国检验检疫科学研究院食品安全研究所阪崎肠杆菌的分类学变化•16SrRNA序列同源性在细菌分类学上的重要作用中国检验检疫科学研究院食品安全研究所阪崎肠杆菌重新分类的依据及结果•重新分类的依据：–的扩增片段长度多态性分析（Amplifiedfragmentlengthpolymorphismas,AFLP）–16SrRNA全序列比较–DNA-DNA杂交实验结果。•2008年Iversen等在记录新细菌类群包括分类、命名、鉴定和系统发育的官方杂志“国际期刊系统与进化微生物学（InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,IJSB）”上发表文章。•建议将阪崎肠杆菌重新分类命名，成为肠杆菌科1个新属，即克罗诺杆菌属（Cronobacterspp.）包括5个新种（其中Cronobactersakazakii称为新组合）、1个克罗诺杆菌基因种（genomospeciese）和三个新亚种，在该杂志通知清单上（2008年，58卷，第6部分）1个新属、5个新种和三个新亚种已公布。中国检验检疫科学研究院食品安全研究所“系统与进化微生物学国际期刊（InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,IJSB）”记录新细菌类群包括分类、命名、鉴定和系统发育的官方杂志中国检验检疫科学研究院食品安全研究所包括5个新种,（其中Cronobactersakazakii称为新组合）、1个克罗诺杆菌基因种（genomospeciese）和三个新亚种.克罗诺杆菌属（Cronobacterspp.）中国检验检疫科学研究院食品安全研究所DNA相关性：同种70%；其它70%；支持克罗诺杆菌应由不同种组成的说法中国检验检疫科学研究院食品安全研究所克罗诺杆菌及相近种细菌的16SrRNA基因进化树中国检验检疫科学研究院食品安全研究所中国检验检疫科学研究院食品安全研究所克罗诺杆菌属（Cronobacterspp.）Cronobactersakazakii，仍以日本细菌学家名字命名，中文应为阪崎克罗诺杆菌；Cronobactermalonaticus，“malonaticus”意为可利用丙二酸盐，中文应为丙二酸盐阳性克罗诺杆菌；Cronobacterturicensis，“turicensis”是瑞士苏黎世的拉丁文名字，中文应为苏黎世克罗诺杆菌；Cronobactermuytjensii，“muytjensii”即Muytjens，是荷兰著名微生物学家，早期从事过大量阪崎肠杆菌方面的研究工作，中文穆汀斯克罗诺杆菌；Cronobacterdublinensis，都柏林克罗诺杆菌，菌株的分离地点，Cronobacterdublinensissubsp.dublinensis，都柏林克罗诺杆菌都柏林亚种；Cronobacterdublinensissubsp.lausannensis，都柏林克罗诺杆菌洛桑亚种；Cronobacterdublinensissubsp.lactaridi，都柏林克罗诺杆菌乳粉亚种，“lactaridi”意为乳粉或奶粉。一个克罗诺杆菌基因种1，Cronobactergenomospecies1。中国检验检疫科学研究院食品安全研究所克罗诺杆菌词源学•名字起源于希腊神话中“Cronos”，克罗诺斯是十二个泰坦巨神之一，传说中的天空间神，当他每个孩子一出生就被他一口吃掉，行为表现形式和该菌的致病特性很吻合，因此，笔者建议将Cronobacterspp.中文翻译成“克罗诺杆菌属”。中国检验检疫科学研究院食品安全研究所克罗诺杆菌属生物学特性•革兰氏阴性杆菌•氧化酶阴性•触酶反应阳性•兼性厌氧•通常有动力•3µm1µm中国检验检疫科学研究院食品安全研究所生长条件范围•6C-45C下可以在BHI中生长；•pH5-10可以生长，低于4.5不生长；•0-7%的NaCI中生长；超过10%不生长；•100mM硫酸铵，硝酸钠、亚硝酸钠中仍可生长；•200mM磷酸钠，5%硫酸钠和20%乙二醇中也可生长；•20mM苯甲酸钠中不生长。中国检验检疫科学研究院食品安全研究所糖醇利用•还原硝酸盐•利用柠檬酸盐•水解七叶苷•水解精氨酸•鸟氨酸脱羧酶阳性•产酸–葡萄糖、蔗糖、棉子糖、蜜二糖、纤维二塘、甘露醇、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、海藻糖半乳糖醛酸酯(盐)、麦芽糖。•VP阳性•甲基红阴性中国检验检疫科学研究院食品安全研究所阪崎肠杆菌主要生化特征中国检验检疫科学研究院食品安全研究所克罗诺杆菌不同种和亚种的生化反应•吲哚•卫矛醇•果糖•丙二酸盐•麦芽糖•帕拉金糖•丁二胺•松三糖•松二糖•肌醇•乌头酸盐•甲基-α-葡萄糖苷•氨基丁酸中国检验检疫科学研究院食品安全研究所简单区分各种的生化反应中国检验检疫科学研究院食品安全研究所阪崎肠杆菌的检测方法•FDA，IsolationandEnumerationofEnterobactersakazakiifromDehydratedPowderedInfantFormula2002•SN/T1632—2005奶粉中阪崎肠杆菌检验方法–SN/T1632.1—2005分离与计数方法–SN/T1632.2—2005PCR检验方法–SN/T1632.3—2005荧光PCR检验方法•ISO/TS22964IDF/RM210Milkandmilkproducts—DetectionofEnterobactersakazakii2006•GB/T4789.40—2008食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验–第一法定性方法–第二法MPN方法KeithLampel基思.蓝佩尔中国检验检疫科学研究院食品安全研究所阪崎肠杆菌检测方法的实验设计传统方法•前增菌–蒸馏水–BPW•选择性增菌–mLST–EE•选择性分离–显色培养基（DFI、ESIA，其他）–VRBGA•主要生化特征的鉴别–产黄色素–DNA酶•生化鉴定–API–VITEK–其他分子生物学方法•前增菌•选择性增菌•目标片段扩增–dnaG.基因，大分子合成操纵子；–gluA.基因，α-葡萄糖苷酶；–rpob基因，编码RNA聚合酶β亚单位的基因–……•分离•鉴定中国检验检疫科学研究院食品安全研究所增菌过程发现的问题•EE肉汤抑制了部分肠杆菌属细菌生长，包括阪崎肠杆菌；•当含量低的目标菌被有效回收时，竞争性的革兰氏阳性菌也能检测的到；•提出在前增菌的BPW中增补：–40µM8-羟基喹啉、0.5g柠檬酸鉄铵、0.1g去氧胆酸钠、0.1g丙酮酸钠中国检验检疫科学研究院食品安全研究所分离克罗诺杆菌新筛选方法•FDA方法：•ISO/TS22964:•CSB增菌肉汤结合DFI琼脂：中国检验检疫科学研究院食品安全研究所CSB克罗诺杆菌筛选肉汤（g/L）•蛋白胨10；•肉浸粉3；•氯化钠5；•溴甲酚紫0.04；•蔗糖10；•万古霉素10mg；•pH7.4±0.1•最佳培养温度：42C中国检验检疫科学研究院食品安全研究所两种显色培养基的成分差别中国检验检疫科学研究院食品安全研究所底物的种类和特点•荧光类水溶性；受pH值影响；强烈扩散；需紫外灯•吲哚类（吲哚衍生物）（新型酶底物）稳定性好；5-Br-4-Cl-3-吲哚（X）：蓝绿色5-Br-6-Cl-3-吲哚（Y）：洋红色6-Cl-3-吲哚：鲜肉色6-F-3-吲哚：胭脂红•酚类如：儿茶酚，苯磷二酚•其他间接反应直接反应中国检验检疫科学研究院食品安全研究所克罗诺杆菌表型特征和遗传特征试验的结果区别X-α-Glu，0.1g/L,3.8%克罗诺杆菌在显色培养基为阴性，当增加到0.15g/L时，又可以变成蓝绿色菌落；肠杆菌科其他菌32%-46%也是阳性。中国检验检疫科学研究院食品安全研究所表型和遗传试验鉴定克罗诺杆菌的结果差异评价•底物反应比商品化显色培养基灵敏度更高，尤其是Cronobactersakazakii和Cronobacterdu