维生素B12的生物合成

就维生素B12的论述专业:生物技术姓名:郑彩霞学号:2012312246电话:[phone]摘要维生素B12是一种重要的动物和人类营养因子,广泛应用于饲料、食品和医药卫生领域。中国已成为全球B12的主要产地,2007年产量为27t,占全球总产量的77%。B12是目前已发现的最大、最复杂的维生素分子。脱氮假单胞菌(Pseudomonasden-itrificans)和费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)是主要的生产菌[1]。维生素B12发酵产量的提高有待于菌种的改良和发酵工艺的改进。关键词钴胺素,维生素B12,生物合成,发酵引言早在20世纪20年代,ＭＩＮＯＴ和ＭＵＲＰＨＹ就发现可以通过食用动物肝脏来治疗恶性贫血症。这个发现激起人们的极大兴趣去研究究竟是动物肝脏中的哪种物质可以治疗恶性贫血症。1948年,美国Ｍｅｒｃｋ公司的ＦＯＬＫＥＲＳ以及英国Ｇｌａｘｏ公司的ＳＭＩＴＨ,同时从动物肝脏浸提物中分离提取出红色结晶物,发现该红色结晶物能有效地治疗恶性贫血症,并将它命名为维生素Ｂ12。维生素Ｂ12在奶粉、浓缩牛肉汁以及多种细菌的培养液中相继被发现。维生素B12在很多方面都有显著作用，如促进红细胞的发育和成熟，预防恶性贫血；维护神经系统健康；以辅酶的形式存在，可以增加叶酸的利用率，促进碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢；也可促进蛋白质的合成，对婴幼儿的生长发育有重要作用；还能消除烦躁不安、集中注意力、增强记忆及平衡感，而且维生素B12参与神经组织中一种脂蛋白的形成，是神经系统功能健全不可缺少的维生素。因此研究维生素B12对动物机体具体十分重要的意义，所以研究维生素B12的生理功能，适宜用量，在动物饲料方面的应用，缺乏以及过量导致的不良影响，而我们又该如何应对这方面的问题，已经引起全世界的普遍关注正文1、维生素B12简介维生素B12又名钴胺素，由3部分组成:中心咕啉环、中心环轴向Coβ配基部分及1个含有核苷酸环的Coα配基。中心咕啉环由相连的4个吡咯和1个钴原子组成,钴鏊合在4个吡咯中心。咕啉环轴向上方的配基不同(即Coβ配基不同),则会产生不同形式的钴胺素类物质。维生素B12是一类带咕啉环的化合物,具有重要的生物学活性,作为辅酶参与分子内重排、核苷酸还原成脱氧核苷酸和甲基转移的反应,临床上常用于治疗恶性贫血[2]。维生素B12分子为深红色结晶体,熔点甚高(320℃时不熔),无臭无味,溶于水、乙醇和丙酮,不溶于氯仿、丙酮和乙醚,结构性质相当稳定;在中性溶液中耐热、酸、碱,日光、氧化剂和还原剂均能使其破坏。维生素B12的主要功能有四种：一是提高叶酸利用率，与叶酸一起合成甲硫氨酸（由高半胱氨酸合成）和胆碱，产生嘌呤和嘧啶的过程中合成氰钴胺申基先驱物质如甲基钴胺和辅酶B12，参与许多重要化合物的甲基化过程。维生素B12缺乏时，从甲基四氢叶酸上转移甲基基团的活动减少，使叶酸变成不能利用的形式，导致叶酸缺乏症。二是维护神经髓鞘的代谢与功能。缺乏维生素B12时，可引起神经障碍、脊髓变性，并可引起严重的精神症状。维生素B12缺乏可导致周围神经炎。小孩缺乏维生素B12的早期表现是情绪异常、表情呆滞、反应迟钝，最后导致贫血。三是促进红细胞的发育和成熟。将甲基丙二酰辅酶A转化成琥珀酰辅酶A，参与三羧酸循环，其中琥珀酰辅酶A与血红素的合成有关。四是维生素B12还参与脱氧核酸（DNA）的合成，脂肪、碳水化合物及蛋白质的代谢，增加核酸与蛋白质的合成。2、维生素B12的生物合成作为最复杂的和十分重要的小分子,维生素B12的生物合成已有详尽研究。维生素B12主要由古生菌和一些真细菌通过有氧或厌氧两种途径合成,涉及到相关合成基因30余个,Battersby、Blanche、Scott、Warren、Escalante-Semerena等通过对脱氮假单胞菌(Pseudomonasdenitrificans)的研究,阐明了VB12好氧合成路径。对厌氧合成路径的研究主要源于以下3种菌:鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)和费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)。费氏丙酸杆菌在生长时会产生大量丙酸和乙酸,有机酸的积累会抑制菌体生长[3],延长了发酵周期。下面将以微生物合成腺苷钴胺素为例,分3部分概述维生素B12好氧及厌氧合成过程。（一）ALA的生物合成B12的生物合成从五碳前体5-氨基乙酰丙酸(5-aminolaevulinicacid,ALA)开始。ALA可通过C4途径或C5途径[4]合成。C4途径中,由琥珀酰CoA和甘氨酸在ALA合成酶的催化下合成ALA。C5途径从谷氨酸开始,在谷胺酰-tRNA合成酶的催化下,谷氨酸转移到tRNA分子上,形成谷胺酰-tRNA,谷胺酰-tRNA在谷胺酰-tRNA脱氢酶的作用下,合成谷胺醛(glutamate1-semialdehyde,GSA),再经谷胺醛氨基转移酶的催化合成ALA。（二）从ALA到尿卟啉原Ⅲ的生物合成这是好氧途径和厌氧途径共同的步骤,该过程由ALA脱水酶(HemB)催化2个ALA分子形成胆色素原(Porphobilinogen),再经胆色素原脱氨酶(HemC)催化形成含4个吡咯的分子前尿卟啉原(preuroporphyrinogen),再由尿卟啉原Ⅲ合成酶(HemD)催化4个吡咯分子环化形成尿卟啉原Ⅲ(uroporphyrinogenⅢ)。（三）前咕啉6(Co-precorrion6)的生物合成该过程涉及环缩合和去乙酰基,是好氧过程和厌氧过程主要不同的环节。在好氧合成途径中形成前咕啉6,催化这一过程需要5个依赖于SAM(S-腺苷-L-甲硫氨酸)的甲基转移酶(CobA,CobG,CobJ,CobM和CobF)逐步转移6个甲基基团,并以单加氧酶催化氧原子的结合而著称。在厌氧合成途径中则将尿卟啉原Ⅲ转化成钴-前咕啉6。该过程也需要5个甲基转移酶(CysG或CbiK,CbiL,CbiH,CbiF),但不同的是早期将钴原子并入到大环中。合成前咕啉2之后,即将钴原子螯合到大环中,形成钴-前咕啉2,具有螯合钴原子的酶在不同生物中所催化的酶不同,如S.typhimurium的CysG、CbiK和P.freudenreichii、B.megaterium的CbiX酶都有相同的酶活性。（四）将前咕啉6/钴-前咕啉6转化成腺苷钴胺素好氧途径中,前咕啉6经还原、甲基化、脱羧、甲基重排及酰胺化反应生成钴(Ⅱ)啉酸a,c-二酰胺(Cob(Ⅱ)yrinicacida,c-diamide)。CobK还原生成二氢前咕啉6(Dihydro-precorrin6),再经CobL催化的C-5和C-15位的甲基化及脱羧,合成前咕啉8,前咕啉8在CobH催化下,经甲基重排形成氢咕啉酸(Hydrogenobyrinicacid),氢咕啉酸在CobB催化下酰胺化形成氢咕啉酸a,c-二酰胺(Hydrogenobyrinicacida,c-diamide),好氧菌利用依赖于ATP的钴鏊合酶(CobNST)催化钴元素插入到氢咕啉酸a,c-二酰胺的咕啉环中心,从而得到具有钴元素的中间体,钴(Ⅱ)啉酸a,c-二酰胺(Cob(Ⅱ)yrinicacida,c-diamide)。在厌氧途径中没有发现CobNST复合物。3、维生素B12发酵生产(一)抗生素废液中提取早在1952年美国T.R.Wood等人就发现,当用加有钴化合物的培养基培养灰色链霉菌时,可大大提高维生素B12在整个培养液中的浓度,但是对于钴化合物的浓度要求要适量,过高的浓度会对菌体细胞产生毒性;另有研究表明,添加适量的氰化合物也同样可促进抗生素废液中B12类似物的含量,但需严格掌握其用量。(二)放线菌发酵自从人们发现可从抗生素废液中提取得到维生素B12后,许多科学家将目光转向了采用放线菌,中主要是链霉菌属中的灰色链霉菌和橄榄色链霉菌来发酵产维生素B12,而于链霉素的生成,而始终未能使得维生素B12的产生处于主导地位,因此,我们应选出链霉素发酵支路的关键酶,并将其抑制,这样便可大大提高维生素B12的得率,使得大量产生维生素B12成为可能。(三)下水道废液中提取采用生物活性污泥法处理的废水中,通常含有多的B12,干的活性污泥可先用水浸提,然后过滤掉固形颗粒,之后可分离、纯化B12。(四)丙酸菌发酵丙酸菌,例如Propionibacteriumfreudenreichii和Pro-pionibacteriumshermanii常用作B12的产生菌,这类细菌常采用厌氧发酵。(五)由巨大芽孢杆菌生产B12以巨大芽孢杆菌为例,将培养基用氨水调至pH7.0,发酵液需要连续不停地搅拌和大量通气,温度需控制在30℃左右,每隔一定时间需用5%的氨水来调pH,同时需定期补充碳、氮源,以期达到最高产量。(六)采用转基因的E.Coli.发酵生产目前,人们对于B12的控制基因已经非常清楚,因此,这就使得将其转入大肠杆菌,以期大量生产,但该方法真正用于大生产还有待时日,即使用于生产,也会不可避免地存在这样的问题,如导入的质粒不能稳定地遗传下去,会随发酵条件的变化而脱落等,因此,就近些年,维生素B12的生产仍需按传统发酵来完成4维生素B12的提取对于维生素B12提取,不断有新的方法提出,主要有两种,一种为溶剂提取法,另一种为离子交换树脂法。(一)有机溶剂提取研究表明,采用两相混合溶剂,可简单地纯化和提取出来,常用的溶剂为苯甲醇和水的混合溶液,基本过程如下:发酵液—吸附(活性碳)—洗脱(吡啶)—浓缩—层析(Al2O3)—洗脱(甲醇)—收集红色液—浓缩—结晶(二)离子交换树脂法提取随着离子交换柱在工业上的广泛应用,人们尝试用阴阳离子交换树脂来进行维生素B12的提取,并取得了较好的效果,过程如下所示:发酵液—阳离子树脂(LonacC-240)—阴离子树脂(LonacAC-300)—蒸馏水冲洗—收集红色液体部分—浓缩—冷冻干燥5维生素B12的测定方法(一)比色测定法本法是药物样品中维生素B12测定的常用方法。其原理是样品经浓硫酸和高氯酸钾消化后,样液中的钴与M-二-(α-吡啶酮)-α-吡啶联腙生成钴的红色化合物,可以进行比色测定,再从钴的含量换算成维生素B12的含量。(二)离子交换测定法药物中的维生素B12可以从弱酸性阳离子交换树脂中得到,分离洗脱下来。例如,桔子酱中的维生素B12通过Florisi土为吸咐剂进行层析分离后,在530nm波长处测定其含量。(三)原子吸收法维生素B12的分子中含有钴原子,占维生素B12的4.35%,采用原子吸收分光光度法可以测定其中的钴含量,再换算成维生素B12含量。在测定药品中维生素B12时,可以直接将药品的溶液吸入原子分光光度计中测定。但用于测定食品中的维生素B12时,先将样品预先处理,样品用提取剂提取,于滤液中加入5.0gEDTA,用NH4OH调节至pH7.0,再加入5g活性炭,振摇,用无灰滤纸过滤,维生素B12被吸附在活性炭上,将活性炭连同滤纸一起在600℃下灰化完全,用5mol/L的硝酸将残渣溶解,然后用原子吸收分光光度法测定钴的含量,本法与微生物法结果一致。(四)微生物法原理同微生物学浊度法,试验菌种采用乳酸酐菌Leichmannii(ATCC7830),灵敏度20ng/Kg。6维生素B12发酵生产近况脱氮假单胞菌(Pseudomonasdenitrificans)和费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)是目前工业应用最广的维生素B12生产菌。脱氮假单胞菌最早应用于工业生产,对它的研究也最为透彻。法国RPR(Rhone-PouleneRorer)实验室利用传统诱变育种方法和基因工程手段已经成功改造了脱氮假单胞菌,使其产量达到约300mg/L。与脱氮假单胞菌相比,费氏丙酸杆菌虽然产量不高,但是它也有自己的优点。费氏丙酸杆菌符合美国FDA的GRAS(generallyrecognizedassafe)要求