DNA测序技术的发展历史与

DNA测序技术的发展历史与最新进展主讲人：邓媛媛李洋•在2002年4月，美国《科学》杂志，登载了一篇长达14页的论文尤其引人注目———《水稻（籼稻）基因组的工作框架序列图》。•2004年12月，水稻基因组“精细图”全部完成•2004年12月10日，中国科学家在世界上率先完成的家蚕基因组“框架图”及基因组生物学分析成果在世界科学类权威的学术期刊——《Science》杂志上发表。•2009年12月13日，Nature杂志刊登了由深圳华大基因研究院领衔完成的大熊猫基因测序。为什么要进行DNA测序？DNA测序的目的就是为了认识生命的本质，了解生物的差异性，以及不同的生物进化和发展的历史。DNA测序对重组DNA的研究提供了方向。DNA测序在疾病诊断和基因分型中有重要的实用价值DNA测序技术对象的发展自20世纪70年代DNA序列分析技术发明以来，人类对基因和基因组结构的研究和探索就没有停止过。1977年测定了噬菌体X174基因组全部核苷酸序列。目前，已分析完成了大批生物的全部基因组序列，包括噬菌体、病毒、细菌、酵母、多细胞真核生物、小鼠和人类。2001年初完成的人类基因组计划使基因组研究达到了高潮，是人类真正认识和自我改造的开端。第一代DNA测序技术三测序方法的原理第二代DNA测序技术三个测序平台的工作原理及操作步骤第三代DNA测序技术单分子测序的特点及应用前景DNA测序技术的历史自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。第一代DNA测序技术成熟的DNA测序技术始于20世纪70年代中期。●1977年Sanger发明了双脱氧链终止法。●同一时期,Maxam和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法。●20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序的时代。这些技术统称为第一代DNA测序技术。一，双脱氧链终止法原理：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4种dNTP存在条件下复制时,在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP),因为双脱氧核苷没有3′-OH,所以只要双脱氧核苷掺入链的末端,该链就停止延长,若链端掺入单脱氧核苷,链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3′端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后,分4个泳道进行凝胶电泳,分离长短不一的核酸片段,长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后,根据片段3′端的双脱氧核苷,便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。二，化学降解法在该方法中,一个末端被放射性标记的DNA片段在5组互相独立的化学反应中分别被部分降解,其中每一组反应特异地针对某种碱基。生成5组放射性标记的分子,每组混合物中均含有长短不一的DNA分子,其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA片段上的位置。最后,各组混合物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,再通过放射自显影来检测末端标记的分子。三，荧光自动测序技术•荧光自动测序技术基于Sanger原理，用四种不同的荧光混合物分别标记四种反应的产物，用四种反应物混合在一起进行电泳，在激光的激发下四种带有不同荧光染料标记物的ddNTP可以在同一反应管种进终止测序反应，并于变性的聚丙烯酰胺凝胶的同一泳道中进行电泳检测。当带有某种荧光素标记的DNA片段电泳到激光探头的检测范围时，激光所激发的荧光信号被探测器接受，经计算机分析数据，自动排列出DNA序列。第一代测序法的比较方法双脱氧末端终止法化学降解法荧光自动测序技术优点操作简便，结果清晰可靠，一次能确定300-500个核苷酸序列，已成为最常用的DNA测序方法不需要进行酶促反应，可以分析甲基化等DNA的修饰情况自动化程度高，高效率，精确度增加缺点花费时间过久，成本较高一次最多只能分析250个核苷酸，所用的许多化学试剂有毒纯化量小，不能纯化较长的片段第二代DNA测序技术·罗氏454公司的GSFLX测序平台·Illumina公司的SolexaGenomeAnalyzer测序平台·ABI公司的SOLiD测序平台二代测序的核心思想是边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列。一、GSFLX测序技术的原理1.样品输入并片段化：GSFLX系统支持各种不同来源的样品，包括基因组DNA、PCR产物、BAC、cDNA、小分子RNA等等。2.文库制备：借助一系列标准的分子生物学技术，将A和B接头（3’和5’端具有特异性）连接到DNA片段上。接头也将用于后续的纯化，扩增和测序步骤。具有A、B接头的单链DNA片段组成了样品文库。3.一个DNA片段＝一个磁珠：单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上。每一个磁珠携带了一个独特的单链DNA片段。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，这样就形成了只包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器4.乳液PCR扩增：每个独特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。对于每一个片段而言，扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增的片段仍然结合在磁珠上。5.一个磁珠＝一条读长：携带DNA的捕获磁珠随后放入PTP板中进行后继的测序。PTP孔的直径（29um）只能容纳一个磁珠（20um）。然后将PTP板放置在GSFLX中，测序开始。放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在ATP硫酸化酶和萤光素酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将萤光素氧化成氧化萤光素，同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。这也就是大名鼎鼎的焦磷酸测序。一、GSFLX测序技术的优点GSFLX系统的测序也是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将优点引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；特点：分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化。Solexa测序技术路线：GenomeAnalyzer系统应用了边合成边测序（SequencingBySynthesis）的原理。加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。这些核苷酸是“可逆终止子”，因为3’羟基末端带有可化学切割的部分，它只容许每个循环掺入单个碱基。此时，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。之后，将这些基团化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸。这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA片段的序列。目前的配对末端读长可达到2×50bp，更长的读长也能实现，但错误率会增高。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。4.数据分析Solexa测序技术的特点①通量高。目前一台机器在两周内最高可产出360G的数据;②准确率高。≥98.5%，同时也有效地解决了多聚重复序列的读取问题;③成本低。低于传统Sanger测序技术成本的1%;④DNA序列的读取长度不断增加，当前单条序列读长可达到150bp;⑤可以进行Pair-end(PE)双向测序，PE文库插入片段大小范围可由150bp到10kb。正确选择插入片段长度有利于高重复序列含量基因组的组装，这进一步扩展了该技术的应用范围。ABI测序技术•ABI3730XL的测序原理•ABI3730xl常规测序平台采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3'末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupleddevice)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。#三种第二代测序技术对比#测序技术454SolexaSOLiD上市时间200520072007价格（万美元，2007）504559单次反应数据量0.42050读长（bp）40010050优势长读长低测序成本，高性价比高通量，高准确度第三代DNA测序技术第二代测序技术在制备测序文库的时候都需要经过PCR扩增，而这一PCR过程可能引入突变或者改变样品中核酸分子的比例关系。另外，第二代测序的读长普遍偏短，在进行数据拼接时会遇到麻烦。为了克服这样的缺点，业界发展出了以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术。1.Helicos公司Heliscope单分子测序仪基于边合成边测序的思想，将待测序列随机打断成小片段并在3'末端加上Poly(A)，用末端转移酶在接头末端加上Cy3荧光标记。用小片段与表面带有寡聚Poly(T)的平板杂交。然后，加入DNA聚合酶和Cy5荧光标记的dNTP进行DNA合成反应，每一轮反应加一种dNTP。将未参与合成的dNTP和DNA聚合酶洗脱。检测上一步记录的杂交位置上是否有荧光信号，如果有则说明该位置上结合了所加入的这种dNTP。用化学试剂去掉荧光标记，以便进行下一轮反应。经过不断地重复合成、洗脱、成像、淬灭过程完成测序。2.PacificBiosciences公司PacificBiosciences公司的SMRT技术基于边合成边测序的思想，以SMRT芯片为测序载体进行测序反应。SMRT芯片是一种带有很多ZMW孔的厚度为100nm的金属片。将DNA聚合酶、待测序列和不同荧光标记的dNTP放入ZMW孔的底部，进行合成反应。与其他技术不同的是，荧光标记的位置是磷酸基团而不是碱基。当一个dNTP被添加到合成链上的同时，它会进入ZMW孔的荧光信号检测区并在激光束的激发下发出荧光，根据荧光的种类就可以判定dNTP的种类。此外由于dNTP在荧光信号检测区停留的时间（毫秒级）与它进入和离开的时间（微秒级）相比会很长，所以信号强度会很大。其它未参与合成的dNTP由于没进入荧光型号检测区而不会发出荧光。在下一个dNTP被添加到合成链之前，这个dNTP的磷酸基团会被氟聚合物（fluoropolymer）切割并释放，荧光分子离开荧光信号检测区。3.OxfordNanoporeTechnologies公司OxfordNanoporeTechnologies公司正在研究的纳米孔单分子技术是一种基于电信号测序的技术。他们设计了一种以α-溶血素为材料制作的纳米孔，在孔内共价结合有分子接头环糊精。用核酸外切酶切割ssDNA时，被切下来的单个碱基会落入纳米孔，并和纳米孔内的环糊精相互作用，短暂地影响流过纳米孔的电流强度，这种电流强度的变化幅度就成为每种碱基的特征。中国机构主要承担和参与已完成的动植物基因组测序项目物种国内主要承担机构人中国科学院华大基因研究中心等水稻中国科学院华大基因研究中心等家蚕西南农业大学、中国科学院北京基因组研究所和华大基因研究中心等家鸡中国科学院北京基因组研究所和华大基因研究中心等人深圳华大研究院等血吸虫南方基因中心等黄瓜深圳华大研究院等大熊猫深圳华大研究院等蚂蚁深圳华大研究院等总结与展望•三代测序技术的原理各有特点，适用范围也不近相同。•第一代测序技术凭借其长的序列片段和高的准确率，适合对新物种进行基因组长距框架的搭建以及后期GAP填补，但是成本昂贵，而且难以胜任微