肿瘤细胞的培养

第6章肿瘤细胞的培养肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药的敏感性、肿瘤细胞和癌分子生物学特性的重要手段。癌细胞是比较容易培养的细胞，当前所建立的细胞系中癌细胞是最多的。应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点：(1)可免受机体内环境因素的影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化和生物因素对肿瘤细胞生命活动的影响。(2)既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞的结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究癌变的发生机理；(3)可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性和遗传行为的改变。(4)可用于快速筛选抗癌药物和研究耐药机理。(5)研究周期短，比较经济。但是它也有缺点，如长期培养可使细胞生物学特性发生改变；体外实验所得的结果不能完全代表体内的情况，应与体内试验结合研究更为合理等。一、肿瘤细胞培养的生物学特性1、形态和性状形态不规则，细胞界限清晰，伸展较差，核膜、核仁轮廓明显，核仁多、核浆丰富。折光性强，电镜观察细胞表面微绒毛多而细密，与肿瘤细胞具不定向运动和铺着不依赖性有关。2、生物特性癌细胞在无血清或低血清(2%～5%)时仍能生长，营养要求不高，因能自分泌促增殖因子，在软琼脂培养时单个细胞能形成集落，生长方向性消失，再加上失去了接触抑制，癌细胞数量增多时可呈多层重叠生长，细胞饱和密度大，有丰富的三极有丝分裂，分裂指数高，细胞倍增周期短。3、永生性永生性也称不死性，在体外培养中表现为可无限制传代而不凋亡(Apoptosis)，体外培养的肿瘤细胞系(株)都表现有这种特性。但体外培养的永生性和体内肿瘤的恶性(包括侵润性)是两种性状，受不同基因调控的，因恶性肿瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功，生长增殖能力并不旺盛，有时只能传若干代，说明体外培养的永生性可在体外培养后获得的。另外，体外培养的许多细胞系，如NIH3T3、Rat-110T1/2等均具有永生性而无恶性。但两者有相关性，永生性可能是细胞恶性变的某一阶段。4、侵润性侵润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，体外培养的肿瘤细胞仍保持有这种特性，当与正常组织混合培养时，能侵润入其他正常组织中，甚至能穿透人工隔膜。5、异质性所有肿瘤细胞都是由增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成，属于异质性，其中有的衰老、退化，有的处于周期阻滞状态，只有那些处于活跃增殖的肿瘤干细胞才是支持肿瘤生长的成分，肿瘤干细胞易于生长增殖，分离培养干细胞的方法称干细胞培养(有干细胞系和数个亚系组成)。6、细胞遗传性失去二倍体核型，呈异倍体或多倍体，常有标记染色体出现，正常细胞与恶性肿瘤细胞的区别，如表6-1所示。表6-1区别正常成纤维细胞与恶性肿瘤细胞的常用指标指标正常成纤维细胞恶性肿瘤细胞形态棱形或多角形，伸展良好，折光较弱，核浆比例小，嗜碱性弱，核仁较少较小，多核巨细胞少见多角形或细长形，伸展较差，折光强，核浆比例大，嗜碱性强，核仁多、大，常见多核巨细胞生长特性排列有方向性，单层生长，有接触抑制，饱和密度低方向性消失，多层重叠生长，接触抑制消失，饱和密度高粘附性细胞间粘附性强，紧贴壁生长细胞间粘附性弱，易脱落血清的要求必须有血清无需血清能生长在半固体琼脂中生长能力不能生长能生长，形成集落电子显微镜观察核蛋白体较少，微丝微管有规则排列核蛋白体丰富，微丝微管消失细胞膜对低分子物质通透性粘多糖的合成和分泌腺苷酸环化酶活性细胞内CAMP浓度低多高高高少低低对松孢菌素的反应不刺激核分裂，或至多形成双核细胞核持续分裂，形成多核巨细胞致瘤试验不能形成肿瘤能形成肿瘤二、培养肿瘤细胞的生物学特性的检测体外培养的细胞一旦建立细胞系就需要进行一系列的细胞生物学特性鉴定，其目的在于：证明培养的细胞是否来自原来的肿瘤细胞。说明肿瘤组织类型。描述肿瘤细胞的生物学特性。通常要检查下列项目：1、组织起源应说明培养材料起源于哪个胚层、器官组织、什么样供体、何种疾病等，必要时要提供病理诊断鉴定资料。2、形态观察观察细胞一般形态如细胞形状，核浆比例倒置，有丰富的三极或多极有丝分裂，核仁清晰、多个，微丝、微管排列紊乱。3、细胞生长特点检测细胞生长曲线，细胞分裂指数，倍增时间及细胞周期。癌细胞失去正常的接触抑制，呈多层生长，生长旺盛，倍增时间缩短，饱和密度大，分裂指数较高，具无限增殖能力，细胞浸润能力较强等。4、软琼脂培养癌细胞在低密度下仍具有高度存活率，并在软琼脂中形成集落。5、细胞核型分析检测核型特点，染色体数量，有无标记染色体，染色体带型等，癌细胞大多为异倍体，多倍体，并有标记染色体。6、动物致瘤试验裸鼠背部皮下接种1×109~2×109/L癌细胞能生长形成实体瘤，其组织学形态与原发瘤相似。7、组织化学检查癌细胞中脱氧核糖核酸、酸性磷酸酶和磷脂增多，碱性磷酸酶下降，乳酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶活性也改变。8、其他生物学特性检测有凝集试验等。三、肿瘤细胞的取材和培养(一)肿瘤细胞的取材方法培养肿瘤细胞的材料一般来自患者，对实体瘤患者可取原发肿瘤组织或转移灶，有胸、腹水患者可取胸水或腹水，白血病患者可取血液或骨髓液进行培养。1、实体瘤取材方法取术后或活检标本，要尽早浸入无血清培养液保鲜，尽快进行培养。尽可能去除溃疡及坏死组织，避免细菌、霉菌污染，对取自外露的肿瘤组织，应在培养前在含二性霉素B2μg/mL，青霉素200～1000u/mL，链霉素500μg/mL的培养液中浸泡10～20分钟，再用洗液反复冲洗干净后，再作培养。2、体腔液的取材方法在无菌条件下采取体腔液(胸水或腹水)，不需加抗凝剂，可直接以1200r/min收集细胞，不要久置，也不要在冰中冷却，而应尽早接种。3、血液(骨髓)取材法白血病患者可取血液或骨髓，主要以取外周血为研究对象，用肝素抗凝的注射器无菌抽取5～10mL外周血，置于试管中立刻分离培养。(二)肿瘤细胞的培养方法肿瘤细胞对培养基要求不如正常细胞严格，一般常用RPM1640，DMEM、Mc-Coy-5A等培养基，血清浓度不高，10%即可，建议在原代培养时最好能加入生长因子或原患者血清(1%～2%)以利细胞生长，培养方法很多，主要有组织块法、酶消化法、钽网法、脱落细胞法等。原代细胞的培养方法如下：1、组织块培养法将取得的瘤组织去除脂肪\结缔组织及坏死部分，在平皿中用Hanks液洗3次，剪碎组织，切成1~2mm3小块，接种于事先涂有鼠尾胶原的培养瓶（或皿）中，37℃5%或加盖瓶塞在普通恒温箱中培养。2、酶消化法在上述的碎组织块中加入0.25%胰蛋白酶或(2000u/ml胶原酶)在37℃水浴中消化30分钟(或更长一些)，去除消化液，用洗液洗3次，培养液洗1次后，用完全培养基悬浮，并用吸管吹打分散制成细胞悬液，计数。以5×108～10×108/L细胞浓度，在含有10%小牛血清的RPMI1640(或EagleMEM或DMEM)中37℃5%CO2下分瓶(或皿)培养。3、钽网培养法在一张面积约为1cm2的钽网上放入上述剪碎的一块或几块肿瘤组织块(1~2mm3大小)，用镊子轻压，使其粘于网上，再把钽网放入培养皿中，使网下的组织块与皿壁紧紧接触，于37℃5%CO2下培养，每隔2~3天换液一次，5天后可见有上皮细胞从网上移出，并能在相当于肿瘤组织部位形成纯净的单层上皮细胞。3、脱落细胞法将新鲜的肿瘤组织去除脂肪和结缔组织，洗液洗2次后，用刀片将肿瘤组织切成细薄片，在切割的同时有许多上皮细胞脱落下来，脱落细胞经洗涤后，加入完全培养基，便可获得较纯的上层细胞，于培养瓶(或皿)中、37℃5%CO2下培养，每隔2～3天换液，7～10天上皮细胞逐渐长成单层。在原代培养中，常在培养物中混有正常成纤维细胞，若把正常细胞误认为是癌细胞，就会使整个工作失去意义，若不及时去除这些成纤维细胞，由于它比肿瘤细胞生长快，最终能抑制肿瘤细胞的生长。因此，尽早排除成纤维细胞，已成为肿瘤细胞长期培养建系的关键，现已发现有许多因素能抑制成纤维细胞生长(见表6-2)。表6-2抑制成纤维细胞生长的因素方法因素组织细胞选择性附着胰蛋白酶胶原酶胚胎小肠、心肌表皮乳癌选择性附着底物聚丙稀酰胺聚四氟乙烯(Teflon)胶原(猪皮)各种肿瘤转化细胞表皮细胞汇合饲细胞层小鼠3T3人胎小肠表皮正常和恶性乳腺上皮结肠癌选择性培养基D-缬氨酶(Valine)MCDB-710MCDB-153Phenobarbitone肾组织乳腺表皮肝细胞(三)成纤维细胞的排除方法为了在肿瘤细胞中排除成纤维细胞，常采用五种方法，即机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法、密度梯度离心法。1、机械刮除法用不锈钢丝末端的橡胶刮头(用胶塞剪成三角形插入不锈钢丝)或裹上少许脱脂棉制成，装入试管中高压蒸气灭菌后备用(也可用特制电热烧灼器刮除)。程序如下：(1)标记镜下观察，用记号笔在培养瓶(皿)的背面圈下肿瘤细胞的部位。(2)刮除弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶(皿)中，在肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记细胞空间。(3)Hanks液冲洗1～2次，洗除被刮掉的细胞。(4)加入培养基继续培养，如仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至彻底刮净为止。2、反复贴壁法根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离。方法如下(同贴壁传代)：(1)待细胞生长达一定数量后，倒去旧液，用0.25%胰蛋白酶消化后，Hanks液洗2次，加入不含血清的培养液吹打分散，制成单细胞悬液。(2)取三个培养瓶分别编号为A、B、C，首先把细胞悬液接种入A瓶，置温箱中静置培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后，慢慢吸出全部培养物，再接种于B瓶中，然后向A瓶中补充完全培养基置温箱继续培养。(3)B瓶中的细胞静置培养5～20分钟后，按处理A瓶的方法，把B瓶中的培养液和细胞悬液吸出并注入C瓶中，再向B瓶补加完全培养基，C瓶补加少量小牛血清(浓度为10%)。三个瓶一并在培养箱中培养，如操作成功，次日观察，可见A瓶中主要为成纤维细胞，B瓶中两类细胞混杂，C瓶中主要为上皮细胞(癌细胞)，必要时可反复处理几次直至癌细胞纯化为止。3、消化排除法此法曾用于乳癌细胞的培养，具体方法如下：(1)先是用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA(1:1)混合液漂洗培养细胞一次，然后加入新的混合液继续消化直到有半数细胞开始脱落时，立即停止消化。(2)把消化液离心弃去上清，沉下的细胞用培养基重悬并吸入另一培养瓶中，置温箱培养，向原瓶中补加新的培养基继续培养，此法处理后，鉴于成纤维细胞比肿瘤细胞先脱落，原瓶中留下的多为肿瘤细胞，经过几次反复处理，就能把成纤维细胞除净。4、胶原酶消化法本法是利用成纤维细胞对胶原较为敏感的特点，通过消化进行选择。(1)可用0.5mg/mL的胶原酶消化处理，边消化边在镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后即终止消化。(2)用Hanks液洗涤处理一次后，更换新培养基，继续培养，可获纯净肿瘤细胞，若未清除净，可再次重复。5、密度梯度离心法用泛影葡胺和聚蔗糖配制成比重1.025～1.085的密度梯度分离液，加入细胞悬液后，2500r/min离心10分钟，在比重1.025～1.050层为成纤维细胞，在比重为1.065～1.085层为上皮细胞，将收集的上皮细胞经洗液3次后，进行培养可获纯净的肿瘤细胞。最近，有人用SOD来抑制成纤维细胞的生长，这些方法都需进行预试验取得经验，找出适合条件，才能获得好结果。(四)血癌细胞分离培养1、采血与分离白细胞用肝素抗凝的注射器无菌抽取白血病患者外周血5～10mL，置无菌离心管中，斜放于37℃的水浴中，待红细胞沉淀后，将血浆部分吸入另一离心管中，以1500r/min离心15分钟，收集细胞，用含20%小牛血清的RPMI1640[含50u(μg)/mL青、链霉素]培养液调整细胞浓度至1×109细胞/L以上，开始接种浓度要大。培养基中加入患者血清为1%～2%。2、原代培养物的维持：将分离的患者白细胞种入链霉素小瓶中，每瓶3mL在37℃温箱中进行悬浮状态的静置培养，每隔2～3天半量换一次，吸出1.5mL旧液弃去，加入新鲜完全培养基1.5mL。若换液前培养基中的p