实验2-分离以尿素为氮源的微生物

第一章微生物的利用实验2分离以尿素为氮源的微生物课题背景：尿素是一种重要的农业氮肥。但是尿素不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨气以后，才能被植物利用。而土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。什么是尿素和脲酶？（NH2）2C=O+H2O脲酶2NH3+CO2尿素：又称脲，是蛋白质降解的产物。脲酶：降解尿素的酶。如何筛选分解尿素的细菌？原理：培养基中的唯一氮源是尿素，只有能分解尿素的细菌（能合成脲酶）能够在该培养基上正常生长和繁殖。碳源氮源实验原理利用将尿素作为唯一氮源的选择培养基分离出能利用尿素的细菌，再通过稀释涂布分离法，将该菌分散开来，以形成单菌落。细菌合成的脲酶能将尿素分解成NH3，致使pH升高，碱性增强，使酚红指示剂变红。酸碱指示剂：酸黄碱红例题：下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是（）A.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水B.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、琼脂、水C.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、尿素、琼脂、水D.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水选择培养基：只能以尿素为唯一氮源。实验设备及用品三角瓶、试管和试管架、培养皿、超净台、移液器、玻璃刮刀、酒精灯。从土壤中采集微生物土壤采样方法：用小铲子去除5cm表土，取离地面5-15cm处的土样1克，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧。从有哺乳动物排泄物的地方取得稀释涂布分离法玻璃刮刀Step1：培养基的配制和灭菌全营养LB培养基/25mL尿素培养基/25mL蛋白胨0.25g酵母提取物0.12gNaCl0.25g琼脂糖0.5g水25mL葡萄糖0.025gNaCl0.12gK2HPO40.12g酚红0.25g琼脂糖0.5g水15mL尿素溶液10mL特别注意：尿素溶液用G6玻璃漏斗过滤，使之无菌。Step2：倒平板②将已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基在酒精灯火焰旁分别倒入培养皿中，在超净台上摇匀，平放至凝固。冷却至60℃Step3：制备细菌悬液1g土样99mL无菌水10-2稀释液10-3、10-4、10-5稀释液怎样梯度稀释菌液？高浓度→低浓度，换枪头微量移液器平行重复每一个稀释度的菌液：接种到3个培养皿中。Step4：用涂布分离法分离细菌全营养LB培养基（对照组）尿素培养基（实验组）10-310-410-5需要倒3个LB平板，9个尿素平板重复1重复2重复3重复1重复2重复3重复1重复2重复3取10-3、10-4和10-5的土壤稀释液各0.1mL，分别加到有LB培养基和尿素培养基的培养皿中。在酒精灯火焰旁打开培养皿，用玻璃刮刀将菌液涂布到整个平板上。70%酒精恒温培养箱Step5：恒温培养箱中37℃培养培养皿要倒置将培养皿倒置，在37℃恒温箱中培养24～48h。实验结果：全营养培养基中有较多的菌落，而尿素培养基中只有少量的菌落。Step6：观察培养基中的菌落数Step7：统计菌落数目统计菌落数目：①选择菌落数在30～300的平板计数。②每个稀释度取3个平板取其菌落的平均值。③统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。例题：用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中．得到以下几种统计结果，正确的是（A.涂布了一个平板，统计的菌落数是230B.涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238C.涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163D.涂布了三个平板，统计的菌落数分别是2l0、240和250，取平均值233例题：稀释涂布平板法分离纯化土壤中微生物的正确操作步骤是（①土壤取样②称取10g土壤加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，制备土壤提取液③吸取0.1mL溶液进行平板涂布④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107的稀释度A．①②③④B．①③②④C．①②④③D．①④②③思考与练习（1）为什么要用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基？（2）有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用？（3）有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现？（4）与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养基上只有少数菌落？琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物。能将尿素转化为氨，供植物利用，而对生态系统中N元素的循环有重要作用。细菌合成的脲酶能将尿素分解成NH3，致使pH升高，使酚红指示剂变红。能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极少数量。例题：（2012·浙江高考）幽门螺杆菌（Hp）感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。实验基本步骤如下：请回答：（1）在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为Hp含有，它能以尿素作为氮源；若有Hp，则菌落周围会出现色环带。（2）下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是灭菌。A.高压蒸汽B.紫外灯照射C.70%酒精浸泡D.过滤脲酶红（3）步骤X表示。在无菌条件下操作时，先将菌液稀释，然后将菌液到培养基平面上。菌液稀释的目的是获得菌落。（4）在培养时，需将培养皿倒置并放在中。若不倒置培养，将导致。（5）临床上用14C呼气实验检测人体是否感染Hp，其基本原理是Hp能将14C标记的分解为NH3和14CO2。接种涂布单（个）恒温培养箱无法形成单菌落尿素倒平板平板划线分离练一练，识一识稀释涂布分离接种环玻璃刮刀例题：（2011·新课标全国卷）有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。回答问题：（1）在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于培养基。（2）纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即和。（3）为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力。（4）通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、和。无菌技术要求实验操作应在酒精灯附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。（1）原油、选择（2）划线法涂布法（3）强（4）高压蒸汽灭菌干热灭菌火焰