1.2-基因工程的基本操作步骤

第一章基因工程第二节基因工程的原理和技术我们身边到底有哪些转基因食品？黄金大米彩色玉米方形辣椒关于转基因：崔永元PK方舟子崔永元观点：反对转基因食品方舟子观点：支持转基因食品基因工程的基本操作步骤重点内容：①获得目的基因。②目的基因与载体连接，形成重组DNA分子。③将重组DNA分子导入受体细胞。④筛选含有目的基因的受体细胞。⑤目的基因的表达和鉴定。Step1：获得目的基因苏云金芽孢杆菌：Bt毒蛋白基因目的基因：人们感兴趣而需要的特定基因，也叫外源基因。目的基因的序列已知①用化学方法人工合成目的基因。②利用PCR技术扩增目的基因。③逆转录法。模板、原料、酶、能量利用PCR技术扩增PCR扩增仪由美国科学家Mullis于1985年首创。模板的双链DNA解旋，形成单链DNA。引物与单链DNA互补序列配对结合TaqDNA聚合酶从引物起始，进行互补链的合成多次循环，获得大量双链DNA分子①②③PCR：聚合酶链式反应①高温变性：95℃。②低温退火：55℃。③适温延伸：72℃。目的基因的序列未知方法：从基因文库中获取目的基因。基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，与载体连接后，导入受体菌的群体中储存。逆转录基因组文库VScDNA文库基因组文库基因组文库：一种生物的全部基因（国家图书馆）。cDNA文库：一种生物的部分基因（市图书馆）。Step2：目的基因与载体连接形成重组DNA分子①用同一种限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体质粒，产生相同的粘性末端。质粒目的基因切口②用DNA连接酶将目的基因和载体连接在一起，形成重组DNA分子。形成的重组DNA分子可能有多种情况先切割后连接①目的基因-目的基因②目的基因-质粒③质粒-质粒重组质粒基因表达载体的构建插入基因抗生素抗性基因标记基因的用途：筛选含有目的基因的受体细胞。Step3：将重组DNA导入受体细胞导入(转化）扩增大肠杆菌基因工程中常用的受体细胞有：大肠细菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物细胞等。（1）将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法：农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞，并整合到其染色体的DNA上。适用于双子叶植物和裸子植物转BT抗虫棉方法：将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达。基因枪法和花粉管通道法适用于单子叶植物适用于被子植物（2）将目的基因导入动物细胞显微注射技术（3）将目的基因导入微生物细胞感受态细胞法：用CaCl2处理大肠杆菌，增加细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入宿主细胞。转化繁殖感受态细胞易于吸收外源DNAStep4：筛选含有目的基因的受体细胞①②③方法：利用标记基因（抗生素抗性基因）进行筛选。Step5：目的基因的表达和鉴定分子杂交技术方法：DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交；抗原-抗体杂交。个体生物学水平鉴定抗虫或抗病的接种实验。剪切→拼接→导入→筛选→表达例题：如下图所示，两个核酸片段在适宜的条件下，经X酶的催化作用，发生下述变化，则X酶是（A.DNA连接酶B.RNA聚合酶C.DNA聚合酶D.限制酶例题：基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（A.人工合成目的基因B.目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞D.目的基因的检测和表达一、基因工程与遗传育种抗虫棉：将苏云金芽孢杆菌的毒蛋白基因导入棉花细胞。①优点：定向改造生物的遗传性状，克服远缘杂交不亲和的生殖障碍。②缺点：操作复杂，难度大，转基因生物和转基因食品存在安全性问题。基因工程的优缺点用基因工程培育成功的“超级细菌”能分解石油中的多种烃类化合物，还能吞食转化汞和镉等重金属，分解DDT等毒害物质。二、基因工程与环境保护三、基因工程与疾病治疗1978年科学家将合成的人胰岛素基因导入大肠杆菌，每1000L培养液就能产生100g胰岛素，使其价格降低了30%-50%。1g胰岛素/100kg猪胰腺例题：下列有关基因工程操作的叙述中，正确的是（）A.用同种限制酶切割载体与目的基因可获得相同的黏性末端B.以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因的碱基序列相同C.检测到受体细胞含有目的基因就标志着基因工程操作的成功D.用含抗生素抗性基因的质粒作为载体是因为其抗性基因便于与外源基因连接例题：（2012·浙江）天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B，而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确的是（A.提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经逆转录获得互补的DNA，再扩增基因BB.利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因BC.利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞D.将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞例题：如图表示利用农杆菌转化法获得某种转基因植物的部分操作步骤。以下说法错误的是（A.利用含有四环素的培养基可将含Ⅱ的细菌筛选出来B.Ⅲ是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植株C.⑥可与多个核糖体结合，并可以同时翻译出多种蛋白质D.①过程的完成需要限制酶和DNA连接酶的参与例题：（2015·重庆）下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是（）A.表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得B.表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原（起）点C.借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来D.启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用