水源水中微囊藻毒素的遗传毒性与健康风险评价

中国环境科学2010,30(4)：468~476ChinaEnvironmentalScience水源水中微囊藻毒素的遗传毒性与健康风险评价王伟琴1,金永堂1*,吴斌2,孙肖瑜1,庞晓露2,王静2(1.浙江大学公共卫生学院,环境医学系,浙江杭州310058；2.浙江省环境监测中心,浙江杭州310012)摘要：应用美国EPA健康风险评价模型对浙江省101个饮用水源地微囊藻毒素(MC)的健康风险度进行评价,提示水源水中微囊藻毒素-LR(MC-LR)具有较高的非致癌风险.采集MC污染相对严重的A、B2饮用水源,一部分利用树脂对其中的MC进行浓集,另一部分加入稀释的纯毒素MC-LR模拟水源水中MC释放的情况,同时制备相同浓度的纯毒素序列,利用Ames试验检测藻毒素浓集物、水样中藻毒素和纯毒素对细菌的致突变性,彗星试验检测人外周血淋巴细胞可能产生的DNA损伤,微核试验检测鲤鱼红细胞微核的诱发效应.结果表明,与阴性对照组相比,藻毒素浓集物、纯毒素和藻毒素稀释水样均可引起人外周血淋巴细胞DNA的不同程度损伤(P0.01),损伤随着染毒剂量的增加而加重,高剂量浓集物、藻毒素稀释水样A和纯毒素可诱导鲤鱼红细胞微核率上升,在本实验条件下尚未观察到藻毒素浓集物、藻毒素稀释水样及纯毒素在Ames试验中具有显著的致突变作用.利用树脂浓集水源水中MC和向水源水中加入稀释的MC-LR模拟MC释放2种方法切实可行,饮用水源水中MC可诱导鲤鱼红细胞微核率上升和淋巴细胞DNA损伤,具有遗传毒性,可能对人体健康产生的远期危害.关键词：微囊藻毒素；水源水；健康风险评价；遗传毒性中图分类号：X503.1文献标识码：A文章编号：1000-6923(2010)04-0468-09Assessmentongenotoxicityandhealthrisksofmicrocystinindrinkingwatersources.WANGWei-qin1,JINYong-tang1*,WUBin2,SUNXiao-yu1,PANGXiao-lu2,WANGJing2(1.DepartmentofEnvironmentalMedicine,SchoolofPublicHealth,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China；2.ZhejiangProvinceEnvironmentalMonitoringCentre,Hangzhou320012,China).ChinaEnvironmentalScience,2010,30(4)：468~476Abstract：Toassessthegenotoxicityofmicrocystin(MC)indrinkingwatersourceforbacteria,carpandhuman,highhealthriskofMC-LRwasobserved,basedonconcentrationsoforganicpollutantsin101drinkingwatersourcesofZhejiangprovince.Surfacewaterof2typicaldrinkingwatersourceAandBweresampled,whichwererelativelyseriouslypollutedbyMC-LR.ThedilutedmicrocystinofMC-LRwasaddedtothewatersamples,whileMC-LR-containingpurifiedwaterwasprepared.TheHLBresinwasusedtoabsorbandconcentratethemicrocystininsourcewatersamples.Thebacteria,humanperipheralbloodlymphocytesandornamentalcarperythrocyteweretreatedbypurifiedwater,drinkingwatersourceAandB,concentratedwatersamples,andMC-LR-containingpurifiedwater,respectively.ThemutationofbacterialDNAwasassessedbyAmestest.TheDNAdamageofhumanperipheralbloodlymphocyteswastestedbycometassay.Micronucleusofornamentalcarperythrocytewasmeasuredbymicronucleustest.Comparedwithpurifiedwater,drinkingwatersourceAandB,concentratedsamples,andMC-LR-containingpurifiedwaterresultedinDNAdamageofhumanperipheralbloodlymphocytes(P0.01).WiththeconcentrationofMC-LRincreasing,thelevelofDNAdamagewasgrowingup.Likewise,concentratedwatersamplesandMC-LR-containingpurifiedwaterwereabletoinducehigherfrequencyofmicronucleusincarperythrocyte.However,DNAmutationinducedbyconcentratedwatersamples,drinkingwatersourceAandB,andMC-LR-containingpurifiedwaterwerenotobserved.Itispracticaltosimulatethemicrocystin-releasingwithMC-LRdissolvingindrinkingwatersource.MicrocystinindrinkingwatersourcecouldinducemicronucleusincarperythrocyteandDNAdamageinhumanlymphocytes.ItindicatedthatMC-LRmayhavethepotentialadverseeffectsonhumanhealth.Keywords：microcystin；drinkingsourcewater；healthriskassessment；genotoxicity近年来,一些作为饮用水源的湖泊、水库等水体富营养化及蓝藻水华爆发已严重威胁到人民群众的饮用水安全[1].蓝藻水华爆发不仅造成收稿日期：2009-08-27基金项目：浙江省重大科技专项社会发展重点项目(2006C13060)*责任作者,教授,[e-mail]4期王伟琴等：水源水中微囊藻毒素的遗传毒性与健康风险评价469水质下降,而且还释放出内源性藻毒素,其中微囊藻毒素(MC)是出现频率最高,危害最严重的藻类毒素[2],微囊藻毒素-LR(MC-LR)是我国富营养化水体中毒性较大的常见亚型,能强烈抑制蛋白磷酸酶1(PP1)和蛋白磷酸酶2A(PP2A)的活性[3],具有肝脏毒性和肿瘤促进作用[4].常规水处理方法不能完全去除水中的MC[5],为确保居民饮用水安全,迫切需要对MC污染水体的健康风险进行评价,并提出相应的防制措施.目前对水环境污染物的健康风险评价多使用数学模型和动物模型[6],尽管对水中污染物的遗传毒性研究较多,但是对人体可能具有的远期健康效应的评价却较少.本研究对浙江省101个县级以上集中式饮用水源水中的176种污染物进行了监测,结果显示MC是其中分布最广、且非致癌健康风险最高的污染物.因此,采集MC污染严重的水源水样,一部分采用树脂对其中的藻毒素进行浓集,另一部分以水源水稀释不同浓度的MC-LR纯毒素模拟了水中MC不同的污染状况,检测与分析了MC对鱼的生态毒性和细菌致突变性及水源水中不同浓度的MC对人体DNA损伤的远期效应.1材料与方法1.1仪器与试剂CO2恒温培养箱(美国ThermoFisherScientific公司),DYY-11B型水平电泳仪(北京市六一仪器厂),BX51型荧光显微镜及DP50数码摄像头(日本Olympus公司),水族箱(广东日生公司),真空过滤系统(天津津腾实验设备有限公司),Autotrace固相萃取仪(美国Zymark公司),旋转蒸发器(瑞士Buchi公司),氮吹仪(美国Organomation公司),OasisHLB小柱(6mL、500mg,美国Waters公司).MC-LR标准品(瑞士Alexis公司),纯度95%,用色谱级甲醇稀释为500µg/mL的母液,-20℃保存;正常熔点琼脂糖(NMA)、低熔点琼脂糖(LMA)、溴化乙锭(EB)、葡萄糖-6-磷酸、2-甲氯基-6氯代-9-[3-(2-氯乙基)氨基丙胺]吖啶-2盐酸(ICR-191)(美国Sigma);RPMI1640培养基(美国Gibco);柔毛霉素(PharmaciaItaliaS.p.A);2-氨基芴(ALDRICH),其余试剂为国产分析纯.1.2水样采集和检测2008年5月丰水期,采集了浙江省101个县级以上集中式饮用水水源地的地表水样(水面下0.5m),检测了水中MC-LR和MC-RR的含量.太湖是我国第3大淡水湖,是周围城市重要的饮用水源地,近年来蓝藻污染水体事件常有发生,于2008年5月丰水期,采集了该流域湖州地区城北水厂(记为A)和新塘(记为B)2地水样.1.3水环境健康风险评价根据水源地水样检测结果,基于美国EPA推荐的水环境健康风险评价模型[7]对检出MC致癌与非致癌健康风险进行综合评价.水健康风险模型将水环境污染与人群健康危害联系起来,通过收集、整理、解释各种健康相关资料,包括毒理学研究资料、人群流行病学资料、环境暴露因素资料,以风险度为指标定量描述环境毒物对健康的影响程度.1.4水源水中MC的浓集根据水源水样监测结果,A、B两水源水中主要的有机成分为MC(其中分别含0.094µg/LMC-LR、0.091µg/LMC-LR),按文献[8]方法收集样品,经0.45µm玻璃纤维滤膜过滤去除悬浮颗粒,通过OasisHLB小柱进行固相萃取,甲醇、丙酮、二氯甲烷洗柱,洗脱液经旋转蒸发、N2吹干,DMSO定容,使得浓集物中MC-LR浓度为4.5µg/mL,-20℃避光保存备用.1.5水源水中MC的致突变性鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型菌株TA97、TA98、TA100、TA102由浙江省疾病预防控制中心惠赠,经菌株生物学特性鉴定,均符合实验要求.采用苯巴比妥和5′6-苯黄酮联合诱导的大鼠肝匀浆作为代谢活化系统(S9),经Lowry法蛋白定量检测符合实验要求.按照平板掺入法[9]分别对藻毒素浓集物、藻毒素稀释水样及纯毒素的致突变性进行检测,以DMSO稀释水样浓集物,A、B2水源水稀释MC-LR纯毒素,各试验组每皿加入不同浓度的藻毒素浓集物和稀释水样,使得浓集物和水样中470中国环境科学30卷MC-LR的浓度为0.01,0.10,1.00,10.00,100.00µg/L(不包括水源水中MC-LR本底值),分别记为浓集物A、B和水样A、B,并以MC-LR纯毒素作为标准浓度序列.在45℃保温的顶层琼脂中加入0.1mL试验菌株增菌液、0.1mL受试物,需要活化时加10%S9混合液0.4mL,经375%℃CO2培养48h,观察计数产生回复突变的菌落数.每个样品做3个平行皿,同时设阴性对照、阳性对照和自发回变组,重复试验2次.以受试物的回变菌落数为自发回变菌落数2倍以上,并具有剂量-反应关系者定为阳性.1.6水源水中微囊藻毒素的染色体损伤检测健康锦鲤(Cyprinuscarpiod)购于花鸟市场,体重25~40g,体长20cm左右,实验室水族箱(200L,水温20~