疾病关键基因研究方法

上海吉凯基因化学技术有限公司ShanghaiGenechemCo.,Ltd.上海吉凯基因化学技术有限公司ShanghaiGenechemCo.,Ltd.疾病关键基因研究策略与工具赵治国[e-mail]基础研究临床问题科研成果临床应用疾病发生耐药复发与预后早期诊断个性化治疗……筛选基因（相关性研究）证实功能（功能研究）寻找机制（机制研究）文章基金专利诊断靶标的发现个性化治疗标准药物研发转化医学的基本思路项目名称依托单位批准金额内质网应激条件下CHOP直接调节p53基因的转录来抑制结肠肿瘤生长的机制研究复旦大学65SNAREs介导膜运输障碍与BMPRⅡ关系及其在肺动脉高压发病中的作用中国医学科学院阜外心血管病医院7011β-HSD1通过调节RAS通路介导糖尿病心肌病的作用和机制研究温州医科大学18miR-98通过调控动脉内皮LOX-1表达抑制动脉粥样硬化形成的研究安徽医科大学18MicroRNA-214介导的Pim-1蛋白表达抑制通路在心肌肥厚中的作用及其机制研究浙江大学43Kindlin-2调控Ras/ERK信号促进肾成纤维细胞的增殖与活化及肾纤维化的机制研究北京大学23LNK基因影响JAK-STAT信号通路导致骨髓增殖性肿瘤发生的机理北京大学70Cdlk1基因在非小细胞肺癌中异常高表达及其通过Notch信号通路促进肿瘤转移的分子机制研究中国医学科学院肿瘤医院23HCRP1负调控EGFR在乳腺癌细胞增殖、迁移和耐药逆转中的作用及机制山东大学23近年获得资助国自然基金列表选取典型SCI文章精要分析CircRes.2015Sep2.pii:CIRCRESAHA.115.306624.[Epubaheadofprint]miR-206MediatesYAPInducedCardiacHypertrophyandSurvival.IntJCardiol.2015Jul2;201:38-48.doi:10.1016/j.ijcard.2015.06.163.miRNA-204drivescardiomyocyteproliferationviatargetingJarid2.JBiolChem.2012Dec3.Netrin-1PromotesGlioblastomaCellInvasivenessandAngiogenesisbyMultiplePathwaysInvolovingActivationofRhoA,CathepsinBandCREB.CancerSci.2012Nov24.Tumor-suppressivemicroRNA-135ainhibitscancercellproliferationbytargetingthec-MYConcogeneinrenalcellcarcinoma.A基因通过调控B信号通路影响C疾病的D功能1.筛选基因（相关性研究）:A--C组织水平：临床组织样本基因的表达情况临床水平：基因表达水平与各种临床特点的相关性2.证实功能（功能研究）:A--D细胞水平：生长，,衰老，炎症反应，凋亡，转移，侵润，血管新生，耐药动物水平：生长，转移，炎症反应，药物敏感3.寻找机制（机制研究）:A--B分子水平：信号通路，相互结合，表达调控，翻译后修饰前，降解调控，剪切调控，胞内定位等创新点来自于A，研究成功的关键点是也A研究的创新点——功能基因A序列号影响因子Pubmed相关文章数临床相关性功能研究机制研究细胞水平动物水平10.871832yesyesyes23.69323NOYesYes310.73418yesyesyes相对“新”的基因更能出好的成果A基因通过调控B信号通路影响C疾病的D功能文献实例基因A肿瘤C/临床相关性功能D/实验方法通路B杂志名IFGOLPH3前列腺癌针对病人样本（342例）的预后生存期判断。--_DiagnosticPathology2012,7:1271.85胶质瘤U251、U87_肿瘤迁移与侵袭RNAi，划痕，侵袭RhoABBCR(2013)2.41胶质瘤U251、U87针对病人样本（97例）的预后生存期判断增殖与预后RNAi，过表达，CCK8_Jneuro-oncology,24August20123.12乳腺癌MCF-7，MDA-MD-231成对样本（6对）基因表达差异，大样本（258例）生存期分析增殖与肿瘤形成RNAi，过表达，MTT&Brdu，克隆形成，裸鼠成瘤FOXO1ClinCancerRes2012;187.84OncostatinMIsaMajorMediatorofCardiomyocyteDedifferentiationandRemodeling要素分析：A基因-OncostatinMC疾病-DCMandAcuteMID功能-DedifferentiationB基因或信号通路-Ras/Raf/MEK/Erk亮点：详尽的临床相关性+细胞与动物水平功能实验+合理的机制性研究图1:OSM与在DCM病人样本和正常对照样本中的相关性研究临床相关性Western-blot临床样本中检测发现OSM表达差异图2:OSM促进心肌细胞的增殖和去分化细胞功能学实验（细胞水平）原代心肌细胞检测添加OSM后心肌细胞增殖和去分化的分子marker图3:OSM促进心肌细胞的增殖和去分化细胞功能学实验（动物水平，转基因鼠）图4:OSM可以通过Obeta激活RAS/RAF/ERK信号通路机制性研究（细胞水平检测下游信号通路）图5:OSM可以通过Obeta激活RAS/RAF/ERK信号通路机制性研究（动物水平检测下游信号通路）如何寻找一个功能基因A文献调研基因芯片功能基因A创新研究移植研究1.创新度差2.不一定成功差异基因很多（几百～几千）如何选择？芯片下游的工作~30000个基因表达谱芯片数百~数千个表达差异个基因相关基因功能基因?引起疾病的因疾病引起的果以及平行性因素功能学验证基因功能的基本研究方式1.对目的基因的操作表达上调,表达下调无→有，有→无，低→高，高→低2.功能（表型）的检测生长,凋亡,自噬,细胞周期,运动能力，侵袭，血管新生……CRISPR/Cas9技术介绍CRISPRProvidesAcquiredResistanceAgainstVirusesinProkaryotes在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界庞大的噬菌体种群，细菌进化了CRISPR介导的适应性免疫CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫，而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定免疫功能的发挥由CRISPR间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔序列（spacer）实现ELIZABETHPENNISI,Science,2013CRISPR/CassystemsHomologousRecombinationAnnu.Rev.Biochem.2008.77:229-257Non-homologousendjoiningAnnu.Rev.Biochem.2010.79:181-211MechanisticflexibilityEnzymemultifunctionalityIterativeprocessingGeneGenomicDNAGeneGenomicDNANonhomologousend-joiningGeneGenomicDNAFrameshiftmutation第二、三代组成型基因敲除基本原理TargetingWild-typealleleDNAHR-LHR-RDonorplasmidTargetedalleleDNAHomologousRecombination第二、三代组成型基因敲入基本原理使用该技术的文章逐年呈几何级数增长，最热门的生物技术！CRISPR/Cas9技术CRISPR/Cas9相关产品（基因编辑动物）CRISPR/Cas9组成型KO/KI大小鼠至少3只F1代大小鼠不同基因操作难度不同CRISPR/Cas9条件型KO/KI小鼠至少3只F1代小鼠不同基因操作难度不同CRISPR/Cas9定点突变大小鼠至少3只F1代大小鼠不同基因操作难度不同CRISPR/Cas9产品CRISPR/Cas9慢病毒产品不用筛单克隆细胞株了！慢病毒双载体单慢病毒定位，筛选：GV392：LV-sgCas9-P2A-puroGV393：LV-sgCas9-P2A-EGFP什么情况下可以使用慢病毒CRISPR/CAS9技术：找不到有效干扰靶点？基因超过4K？Science.2014Jan3;343(6166):84-7.少量的蛋白表达还是能产生功能敲除后功能失去什么情况下可以使用慢病毒CRISPR/CAS9技术：花点钱再增加一下文章档次？CancerCell.2014May12;25(5):652-65.doi:10.1016/j.ccr.2014.03.016.Epub2014May1.MLL3isahaploinsufficient7qtumorsuppressorinacutemyeloidleukemiaRNAi证明：CRISPR/CAS9验证：瓶颈或核心不是基因操作技术而是找到那个基因~30000个基因表达谱芯片数百~数千个表达差异个基因芯片下游的工作简单数据分析数十到数百个基因常规生物信息学分析Go&Pathway等其他大部分芯片服务公司能提供的服务找不到新基因，更找不到新功能基因20~30个基因功能基因（10%）功能学验证个性化的生物信息学与文献分析机制研究方法A-B-C-D我们已经找到好的A机制研究就是去寻找B如何是个好的B？如何寻找？机制研究三大类：1，分子相关性上下游信号通路检测。A基因改变后，下游信号通路B如何改变。（巨人的肩膀）项目名称依托单位批准金额内质网应激条件下CHOP直接调节p53基因的转录来抑制结肠肿瘤生长的机制研究复旦大学65SNAREs介导膜运输障碍与BMPRⅡ关系及其在肺动脉高压发病中的作用中国医学科学院阜外心血管病医院7011β-HSD1通过调节RAS通路介导糖尿病心肌病的作用和机制研究温州医科大学18miR-98通过调控动脉内皮LOX-1表达抑制动脉粥样硬化形成的研究安徽医科大学18MicroRNA-214介导的Pim-1蛋白表达抑制通路在心肌肥厚中的作用及其机制研究浙江大学43Kindlin-2调控Ras/ERK信号促进肾成纤维细胞的增殖与活化及肾纤维化的机制研究北京大学23LNK基因影响JAK-STAT信号通路导致骨髓增殖性肿瘤发生的机理北京大学70Cdlk1基因在非小细胞肺癌中异常高表达及其通过Notch信号通路促进肿瘤转移的分子机制研究中中国医学科学院肿瘤医院23HCRP1负调控EGFR在乳腺癌细胞增殖、迁移和耐药逆转中的作用及机制山东大学23近年获得资助国自然基金列表选取典型SCI文章精要分析CircRes.2015Sep2.pii:CIRCRESAHA.115.306624.[Epubaheadofprint]miR-206MediatesYAPInducedCardiacHypertrophyandSurvival.IntJCardiol.2015Jul2;201:38-48.doi:10.1016/j.ijcard.2015.06.163.miRNA-204drivescardiomyocyteproliferationviatargetingJarid2.JBiolChem.2012Dec3.Netrin-1PromotesGlioblastomaCellInvasivenessandAngiogenesisbyMultiplePathwaysInvolovingActivationofRhoA,CathepsinBandCREB.CancerSci.2012Nov24.Tumor-suppressivemicroRNA-135ainhibitscancercellproliferationbytargetingthec-MYConcogeneinrenalcell