细胞培养的污染及控制(二)

显微镜下识别细菌污染细胞培养的污染及控制（二）判断培养基污染的一般经验判断污染的一般经验：如果是细菌污染，应该很快培基就浑浊了，常见为明显或不明显的成串状，生长很快，培养基很快变得似泥沙状混浊，黑点移动速度非常快如果是真菌感染，特别是初期污染，在低倍镜下可以看到小黑点，特别是成团的小黑点，要特别注意。如果无法确定，就换高倍镜，如果是死细胞，高倍镜下就可以分辨，而真菌高倍镜下仍然是小黑点鉴别判断事实上，判断早期的细菌污染并不容易。特别是某些细菌生长比较缓慢，量比较少时，容易和细胞碎片相混淆遇到上述情况有多种鉴别判断方法，常见的方法及其优缺点见下表：常用鉴别方法的对比常用方法基本操作优缺点持续培养观察法把疑似培养物单独标示出来，继续培养，24或48小时后再进行大体和镜下的观察，对比混浊度变化优：稳妥、不容易误判和漏判；缺：耗时、容易耽误细胞换液或传代以及发放时机取样培养或涂片法通过无菌操作取出部分培养物进行菌培养，或取出进行革兰氏染色镜下识别优：客观、可以识别某些污染类型，利于排查缺：相对繁琐，易在操作中引入新的污染、存在一定的假阳性或假阴性直接镜下识别法运用高倍镜（400倍）对疑似污染的培养物进行观察，从黑点的分布、运动特征、外观形态综合判断优：高效、无须对培养物进行额外操作缺：需要丰富经验，主观性强，有一定的误判率直接镜下识别法以上方法往往不是单一运用，请实验室结合本地实际情况综合应用任何方法之目的只有一个：不让污染的细胞流入临床应用注：本幻灯主要介绍直接镜下识别法的一些注意事项和提供一些图例进行交流直接镜下识别法1、选用40倍物镜，相差调到适合400倍观察的档位，亮度不要太强或太暗，以便于观察疑是污染的小黑点2、观察过程中保持放置显微镜的实验台平稳，培养物先在载物台上静置片刻后再观察，期间请勿晃动培养物3、观察中合理应用显微镜的微调，随时进行调节，以观察小黑点不同平面的影像，以便对小黑点的整体外观形态进行判定直接镜下识别法4、注意观察小黑点与细胞的大小比例，通常细菌是针尖大小，分布相对均匀，而细胞碎片则大小不一；除部分杆菌外，细菌镜下呈小圆点状，可呈链状、串珠状或团簇状排列5、小黑点的运动状态是该识别法的关键，一般来说，有鞭毛的细菌运动剧烈，常见的有大肠杆菌；无鞭毛的细菌运动相对较慢，但可以在较短时间内游动一定距离，而细胞碎片只做原地的不规则运动（布朗运动）直接镜下识别法经验分享：观察可疑黑点时，可以在镜下选择黑点附近的三个细胞或团块形成一个三角座标，观察可疑黑点的运动情况，通常如果是细菌的话，其运动会比较剧烈，可能很快就“游”出三角座标的范围，如果是一般的细胞碎片，通常运动比较缓慢，不容易离开该三角区域。（如下图所示）细胞细胞细胞可疑黑点练习方法：直接镜下识别法使用六孔板或者培养皿，盛少量培养液，再使用干净棉签沾染少量外界细菌与培养液内，然后分时间段进行观察，通常为每隔4~8小时观察一次，可观察到菌量增加的过程注意：上述方法观察到的微生物较杂，如希望观察单一细菌，可对琼脂板上的菌落进行挑克隆培养观察。同时，该练习方法最好在净化间以外进行，以免污染环境或培养物图例：未被细菌污染的贴壁细胞图例：细菌污染的贴壁细胞培养液泥沙样改变，细胞皱缩。未见明显的链条样菌类或长杆菌。图例：细菌污染的贴壁细胞链状细菌残留的细胞图例：绿色滤镜下观察的细菌污染图例：绿色滤镜下观察的细菌污染图例：绿色滤镜下观察的细菌污染注意事项•在现实工作中，您是否也成看到过类似上面三张图片的情况？可是在放置继续培养后，却发现不是污染。事实上，早期的污染不容易观察，从图片中往往不易判断是细菌污染还是细胞碎片。•单纯镜下细菌污染的判断是一个经验积累的过程，需要在不断的练习过程中找到相应的识别技巧，也要不断的补充相关的微生物知识，才能帮助您有效的辨别是否细菌污染。•如何单纯的镜下观察无法判断，请根据您实验室的具体情况，综合应用各种辅助检测方法，以确保污染被排除在细胞发放之前，保证临床安全。附1：值得交流的发细胞经验原则（脐血）1、培养液颜色与平常不一样的，暂时不发，留观察。出现培养液颜色不寻常的原因可能是：红细胞多（红）；细胞生长不良（红）；微生物污染（混红或黄）2、细胞状态不同寻常的不发，留观察。细胞状态不同寻常可能是：微生物量少，难以辨别出来，但其毒素已经使细胞形状发生改变；病毒或支原体污染，容易无法观察，但通过细胞形态可以间接判断其可能性3、细胞培养时间太短的不发。通常为四天以上，培养体系才会表现出一些较为明显的特殊性状附2：当发现培养的细胞出现污染情况时，您将采取什么措施进行处理？常规处理指导原则：1、立即封存使用过的物品、耗材2、启用警示信号，通知相应实验室负责人3、启用备用组物品、耗材4、辨别污染类型，留相片或实物5、排它法进行排查，包括原料血、耗材、设备、空间环境、操作6、找出源头，进行控制