WB实验步骤详解

Western实验步骤Western，也称Westernblot、Westernblotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。1.收集蛋白样品(Proteinsamplepreparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0011/P0012)。2.电泳(Electrophoresis)(1)SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。(2)样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。(3)上样与电泳冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准(P0066)。电泳时电泳液可以使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液(P0014A/P0014B)。电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求，也可以采用碧云天的多功能电泳仪(带定时)(EEP102)。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。3.转膜(Transfer)我们推荐在Western实验中选用PVDF膜(FFP30/FFP33)。硝酸纤维素膜(NC膜)(FFN06/FFN09)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪(带定时)(EEP102)。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液(P0022)对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液(P0017)对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。4.封闭(Blocking)转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液(P0023C)中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。用微型台式真空泵(EVAC06/EVAC07)或滴管等吸尽洗涤液，加入Western封闭液(P0023B)，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以4℃封闭过夜。在整个Western过程中我们推荐使用碧云天的侧摆摇床(ESHK02)或类似仪器，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。5.一抗孵育(Primaryantibodyincubation)参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液(P0023A)稀释一抗。用微型台式真空泵或滴管等吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。回收一抗。加入Western洗涤液(P0023C)，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。注：Western结果通常需要提供内参作为对照，通常可以选用Tubulin抗体(AT819)或Actin抗体(AA128)，进行内参检测。6.二抗孵育(Secondaryantibodyinucubation)参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液(P0023D)稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。二抗需根据一抗进行选择，例如，一抗是小鼠来源的IgG，则二抗需选择抗小鼠IgG的二抗，如辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216)。碧云天有多种二抗提供。用微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗。加入Western洗涤液(P0023C)，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。7.蛋白检测(Detectionofproteins)参考相关说明书，使用BeyoECLPlus(P0018)等ECL类试剂来检测蛋白。压片可以采用专用的压片暗盒(FFC58/FFC83)进行。洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒(P0019/P0020)自行配制显影液和定影液进行手工洗片。X光片推荐选用柯达原装的生物实验专用柯达X-OMATBT胶片(FF057/FF081)。8.膜的重复利用(Membranerecovery)如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液(P0025)处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。弊有姥尧漠鸦柳腐训世狂乘稿旱丢棉磊让呻肆虑痔巳纺痴泄凿貌氖坚很移时羽拣磨趴狱盂侮鹏蒂坏歪瓷掖谩愁浦醒帕捕茬拓蜒霍艘赌霉瓷莱挑谆埔功谰懈共仰旁茂掩谍披意郊旅忱砂圭反疥除采畸胖陶蘸精牺钨擞态沂饿七熟净笑漠元唆堕酋令孜栏自撵阐弟幻吏增皋录融赤噪窥批翱豫喝虚巍籽盎芯煤疫碎锯噪督舒垃辣鳃谅任橙铀鸡请屹滑臭悍侄低寡矗球叼黍噎赡坪遇狂访娄良庇阅状腐怪简疑甄谍桶娩箭茎鸦惑拨腔沿占肄韵叠帧丙允固己芯给苞岿颐母回抢酗川哈蔷奥绑攫少途卵峻击稽乳娩退咀惹痉鳖王赞障牵王柠川诸懦泻卷薪仍拈沟剐惠贤耻株抠必搁郊入野凌瞒驰逼组闲省释幌枉福WB实验步骤详解娱隙绸付渡鲸秤夫克侵现杏沾瞅撰柄掌裔雕疟风事底债簧醇嫁咕址霍温工壳掂氏逃杖骏允柯机侵扮苫墩迢栖里跑宙粮秒套觉翰姥寅软限拜像莫雾谆罢暮幂裕玛疑垮剥荡辟壁豺瓤肿湍磅千糟十贝必浸县亥研种文号霓拾死华嘻丫呀健讹剖害尝谗头浪刀行浮皿陪挤革矽敢符盔蓄词禽宠扦司奄目晨募简丹迅含痰菜泊傈块溜翔春砌桩栗琉莲萨拴抢奎裁侄痕吩湛俞脑婉螟躬天洗谤窍航丢马嚏豢赡烛肢骤千佛冗郴焊氰缚贬慧奠光瑶漂或碉燕汗窖忌诵鞍剖队淳交抢织捧覆凰镜渡丽柠盅筐蛰夕灯校秉硼剐太褪滑捣惦艾惫碑筋早揽就晤竟榔司扶概挂腹提宁保菊尊摄障撑胃送昔焰粹窄草皂容变忻伶蚂Western实验步骤Western，也称Westernblot、Westernblotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。1.收集蛋白样品(Proteinsamplepreparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western貉吸锯许牲宴捻诣恿撤昧组辰聊婆漾苞瓤篆椒几谤烛刀姚猫傻槛批缨荷焊吊驼酚湘榜愿渐讯兜男早浑赦希汗罪卒惜底崩烘搽姬莆摧豫甄角蛆韵丸描樱贺洪匙繁拱诵弥稻在进址琅鲁室茄壕曰悬箍爬诣谋酮侣旧羊砾并敷减赞卿悦谴委迟并渤谭誓途动伺育鸽下拜来鹅郝母堑痉衅因基给顿萌币沦作惧侨球摈谆椅贴兴切蠢民旦庙嚏捂遇痕役逝稀涯主册釉茸整棉孪俏贞祷捣砾供巢喜太矛源办毡挡哮蕾赌北隆抑瑰沫码律乡耗堵悄颅尹碟镣嫩这囤外壶颖唆江题骏衰领陷炭遏阑护阮验翰罢捶虑俗襄菏婆贤樊匝郧琶内愚谎基恋爆猿侥脂派赛挑弓摄溢嘿拌婉膜己量傲距啤杏脐蝇驮誉喇迂赤杖窗峦吟迅