2蛋白组学-二维电泳1

蛋白质组学浙江大学生命科学学院江辉[e-mail]密码：shenghua蛋白质组学研究思路和技术二维电泳质谱技术生物信息学第二章二维电泳与蛋白质分离一、蛋白质的提取与样品制备二、二维等电聚焦-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳三、胶上蛋白质检测技术一、蛋白质的提取与样品制备从生物材料中获得所需蛋白质样品的过程意义蛋白质组分析的基础，也是研究工作第一步制备的完整性、纯度、浓度对下面分析非常重要无完全通用技术（技术和大量经验的结合）包括分离、提取、纯化（分开、结合、省略）分离：生物样品提取液中的蛋白质与其它大量杂质分开提取：将已经与其它物质分开的蛋白质提取出来（如沉淀等）纯化：对提取的蛋白质进一步清除杂质成为纯度高的蛋白质样品（如亲和纯化等）二维电泳分析中的样品制备（目标蛋白在细胞中的存在方式）稳定性（热、pH、蛋白酶、化学试剂等）丰度定位（膜、细胞质、细胞器等）溶解性（可溶、微溶、难溶、不溶）分离难易程度制备变性、活性蛋白二维电泳分析中的样品制备制备原则：尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白质损失。（1）明确研究目标，获得尽可能多的感兴趣蛋白。（2）不同类型的蛋白质需要不同的方法（3）考虑目标蛋白性质，细胞破碎选择温和和激烈两种方法应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。防止样品（特别是溶解性低的蛋白如膜蛋白）在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止在样品制备过程中发生样品降解（如酶性或化学性降解等）。防止发生化学修饰（加入尿素之后，加温不要超过37°C，以防蛋白质氨甲酰化）。破坏蛋白质与其它大分子之间的相互作用，形成线性、独立的肽链样品裂解液新鲜制备，并且分装冻存于-80°C，不要反复冻融样品。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。通过超速离心清除所有的杂质。主要去除盐、小分子化合物、脂类、离子去污剂、核酸、多糖、脂类、酚类等尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。蛋白质制备流程分离、提取、纯化分离：组织或细胞破碎最大程度的细胞破碎最小程度的蛋白水解或降解提取：分离或沉淀蛋白质（可选择）去除杂质（除盐、小分子化合物、脂类、离子去污剂、核酸、多糖、脂类、酚类等）冷冻干燥、沉淀（TCA、丙酮）等纯化：去除无关杂质（可选择）反复提取分级提取样品类型整体样品：单细胞微生物、微生物混合菌等组织样品：器官（肝脏）、植物组织（根、叶）等细胞（细胞器）样品：培养细胞、分离细胞、细胞核、线粒体等可溶性样品：血清、尿液等细胞裂解的方法1、温和裂解的方法:裂解对象主要是一些容易裂解的细胞，如组织培养细胞、血细胞和微生物等。同时温和裂解方法可用于一些亚细胞分级产物，如线粒体、高尔基体和膜等。细胞破碎方法应用对象操作步骤渗透溶胞法非常温和的裂解方法，可用于进一步进行亚细胞分级。血细胞、组织培养细胞将细胞悬浮于渗透溶胞溶液中，细胞溶胀而释放出细胞内容物冻融裂解许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解。细菌细胞、组织培养细胞使用液氮，快速反复冻融至符合实验要求为止。裂解液裂解含去污剂的裂解液处理组织、细胞以裂解细胞膜，使细胞内容物释放出来。组织培养细胞将细胞直接置裂解液或样品液中，进行悬浮处理。酶裂解有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温和裂解植物细胞、细菌细胞、真菌细胞将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。2、剧烈的细胞裂解方法:破碎不容易破碎的细胞如固体组织中的细胞或有坚韧细胞壁的细胞细胞破碎方法应用对象操作步骤超声波处理超声波产生剪切力使细胞破碎悬浮细胞要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫，样品处理应在冰浴中进行压力杯法（FrenchPress）用高压使细胞穿过小孔，产生剪切力从而撕破细胞微生物细胞，如细菌、霉菌、酵母细胞及含有细胞壁的细胞将细胞悬浮液置于预冷的压力杯中，施加压力，然后收集挤出液研磨法固体组织细胞、微生物细胞组织或细胞预先用液氮冷冻，然后置瓷研钵中研磨成粉末。加氧化铝或砂有助于研磨机械匀浆法（防止细胞破碎释放出蛋白酶，引起蛋白质修饰）固体组织，如心脏、肝脏、肾脏组织和细菌悬液先尽量将组织剪成小块，然后加有蛋白酶抑制剂的冷匀浆液进行匀浆，过滤或离心收集。蛋白质的分离与提取方法硫酸铵沉淀高盐溶液中，蛋白倾向聚集沉淀；但很多蛋白即使在高盐中也可溶搅拌情况下，缓慢滴加(NH4)2SO4到饱和，离心分离蛋白三氯乙酸沉淀10-20％即可沉淀蛋白；再溶解困难丙酮沉淀常用方法加入3倍以上体积丙酮，-20C沉淀2h以上，离心分离蛋白三氯乙酸－丙酮沉淀同时加入三氯乙酸和丙酮，-20C沉淀，离心分离蛋白；再溶解困难苯酚提取－甲醇中乙酸铵沉淀饱和酚提取蛋白，甲醇中用NH4Ac沉淀蛋白，依次用NH4Ac和丙酮洗涤沉淀裂解液的组成目的：加入裂解液主要是确保一向等电聚焦之前样品的完全溶解和变性组成：IPG缓冲液（IPGbuffer）：Tris等离液剂（ChaotropicAgents）：硫脲和尿素去污剂（Detergents）：SDS、TritonX-100、NP-40、CHAPS等还原剂（ReducingAgents）：β-巯基乙醇、DTT或TDF（二硫赤藓糖）和三丁基膦(TBP)等两性电解质（Carrierampholytes）蛋白酶抑制剂（proteaseinhibitors）：PMSF等离液剂（ChaotropicAgents）尿素是最常用的离液剂，2mol/L硫脲和5-8mol/L尿素联合使用（硫脲在水中的溶解性很差）原理：NH2-CO-NH2,NH2-CS-NH2改变或破坏氢键等次级键的结构，使得蛋白质变性并使蛋白酶失活破坏了疏水键（防止了聚集作用和二级结构的形成，聚集作用和二级结构的形成会改变蛋白质的迁移性）硫脲和尿素联合使用，可以大大增加蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性使用注意点：样品离心前在室温下至少保持1小时，使完全变性和溶解；样品含尿素不可加热，防蛋白修饰；样品类型不同，选择裂解液的组成也不同去污剂（Detergents）破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用，提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出。类型：离子型：SDS等非离子型：TritonX-100、NP-40等兼性离子型：CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulfonate)、ASB-14(Amidosulfobetaine14)等使用注意：原则上去污剂应该是非离子型或者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质迁移到它们各自的等电点位置。离子型去污剂如SDS不利于等电聚焦。SDS的缓冲液可抑制蛋白质被内源性蛋白水解酶降解，并提高了蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性，因此一般只用于样品处理的初级阶段。CHAPS比其他去污剂溶解疏水性氨基酸残基的能力更好，然而在高浓度脲中的溶解度比较低还原剂（ReducingAgents）断裂蛋白质分子中Cys残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解性。常用的还原剂有β-巯基乙醇、DTT或TDF（二硫赤藓糖）和三丁基膦(TBP)等。DTT是使用比较广泛的还原剂。50mmol/L时能有效地还原大部分的二硫键使用注意点：DTT的pKa在8左右，如果过分提高DTT的浓度会影响到pH梯度。DTT在碱性pH值下会发生去质子化，在等电聚焦时，向阳极发生迁移，使得阴极的DTT损耗而不足。导致二硫键复原，蛋白质沉淀。非离子型还原剂TBP则比DTT更加有效，能大大增加蛋白质的溶解性，在低摩尔浓度下就能使蛋白质得以还原。两性电解质（Carrierampholytes）防止蛋白质过早沉淀在它们的等电点附近，促进蛋白质的溶解。在第一向等电聚焦时，提高极性端蛋白质的聚焦效果。吸附高浓度尿素在溶液中形成的氰酸盐离子。离心时还有助于核酸的沉淀。阻止样品蛋白质和IPG胶条中固相化的两性电解质相互作用。两性电解质对蛋白溶解性和2-DE分辨率的影响pI3.5pI9.5pI3.5pI9.5A：0.5％两性电解质B：2.0％两性电解质蛋白酶抑制剂防止蛋白酶裂解防止细胞裂解时蛋白酶释放出来降解蛋白质。低温、pH9的裂解液可降低蛋白酶活性，但不能真正消除，故得加酶抑制剂（以下一种或数种的混合物）（1）PMSF：苯甲磺酰氟，工作浓度1M，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但在水溶液中失活。（2）AEBSF：可在水溶液中使用，工作浓度4M，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但可能改变蛋白质的等电点。（3）EDTA、EGTA：乙二氨四乙酸和乙二醇双四乙酸的工作浓度为1M，作用对象为金属蛋白酶。（4）肽蛋白酶抑制剂：价格贵，本身会出现二维电泳图中。亮抑酶肽：在DDT中可逆抑制丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶。胃蛋白酶抑制剂A：作用对象为天冬氨酸蛋白酶。抑蛋白酶A肽：作用对象为丝氨酸蛋白酶。苯丁抑制素：作用对象为氨基蛋白酶。（5）TLCK、TPCK：甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮、甲苯磺酰苯氨酰氯甲酮的工作浓度为0.1-0.15mM，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶。清除影响二维电泳图谱的杂质（1）盐、残留的缓冲液和电性小分子盐等带电物质会干扰电泳过程、增大溶液电导率，通常用透析、凝胶过滤、沉淀/重悬的方法脱盐，但易使样品丢失。（2）内源性小分子这些物质通常带负电，使阳极侧的聚焦不全，可采用丙酮/TCA沉淀去除。（3）离子去污剂SDS等离子去污剂，易和多肽形成复合物而干扰IEF，-200C的丙酮溶液可除去。（4）核酸核酸增加样品黏度，导致二维电泳背景发散；能与蛋白质结合，阻碍聚焦；银染时出现高背景。加0.1V的核酸酶溶液(1mg/mlDNAase+0.25mg/mlRNAase+50mMMgCl2)冰上孵育，但要注意核酸酶本身会出现在图谱中。（5）多糖多糖能阻碍凝胶孔径、与蛋白质形成复合物、延长聚焦时间、可能出现水平条纹，可用(NH4)2SO4或苯酚-NH4Ac沉淀后离心，或用超速离心去多糖。（6）脂类脂类易和膜蛋白结合成复合物，改变蛋白溶解性、等电点和分子量，采用大量去污剂可除去。（7）酚类通常出现在植物组织中，通过氧化反应修饰蛋白质，可加还原剂抑制氧化，也可用沉淀法去除，或加抑制剂灭活多酚氧化酶。蛋白质的分级提取在2-DE胶中所能显示出的蛋白质的数量，依赖于细胞中蛋白质的拷贝数、蛋白质的溶解性、蛋白质的上样量及电泳后染色方法的灵敏度。为了能够富集低拷贝蛋白质，采用了样品预分级的方法，如亚细胞分级、亲和分级、蛋白质复合物分级和根据蛋白质溶解性的顺序提取法等。应用双向凝胶电泳分离手段，一步提取法一般只能获得1000-2000个不同的蛋白质点；而使用分级顺序提取方法，对不同组分进行分离，据报道能够获得上万个不同的蛋白质点。主要分步提取策略：蛋白质溶解度蛋白质细胞定位蛋白质亲和力分步提取法（溶解性差异）1998年Molley提出结合高效裂解液分步溶解的技术路线:1、水溶液提取，溶解亲水性蛋白质5-15mg细胞+2ml裂解液I（40mMTris）——反复冻融3-4循环——加适量DNaseI和RNaseA——震荡混均、离心收集上清（沉淀留下一步）、冷冻干燥，得提取物I。2、含Urea/CHAPS/DTT溶液的提取，溶解亲水性、中性和疏水性蛋白第一步沉淀物+50μl裂解液II——剧烈震荡混均，离心收集上清（沉淀留下一步），得提取物II。裂解液II：8MUrea(解聚剂)、4%CHAPS(表面活性剂)、100mMDTT(还原剂)、40mMTris、0.5%Pharmalyte3-10、20μg/mlDNaseI、5μg/mlRNaseA3、含硫脲/SB3-10/TBP溶液的提取，溶解疏水性蛋白第二步沉淀物——40mMTris清洗——200μl裂解液III溶解——剧烈震荡混均，离心收集上清，保存于-70℃。裂解液III：5MUrea、2MT