ABO血型的基因型检测

ABO血型的基因型检测一、实验目的与原理1.目的了解ABO血型的遗传学原理掌握在DNA水平上鉴定ABO基因型的基本原理和操作过程2.原理ABO血型抗原是由IA;IB;i基因编码的特异性糖基转移酶催化合成的红细胞膜表面的糖蛋白和糖脂。ABO基因座位位于第九号染色体上,其3个等位基因IA、IB、i形成4种主要的血型A、B、AB和O。ABO血型系统遗传方式A血型：IAIA;IAiB血型：IBIB;IBiAB血型：IAIBO血型：iiIA基因与IB基因之间在cDNA上有7个单碱基替换：A294G、C523G、C654T、G700A、C793A、G800C和G927A。i基因与IA基因相比只是cDNA的第258位的胞嘧啶缺失，出现框移突变，使第352位的1-rA变成了TAA(终止密码子)，提前终止了转移酶的合成，导致合成的转移酶没有活性区，所以在红细胞膜上没有Ａ，Ｂ抗原的产生。根据genebank上公布的IA、IB、i基因序列设计引物，扩增ABO糖基转移酶基因中的2个区段。引物由上海生工合成，引物序列为：引物1：5′-CACCGTGGAAGGATGTCCTC-3′引物2：5′-AATGTCCACAGTCACTCGCC-3′引物3：5′-GTGGAGATCCTGACTCCGCTG-3′引物4：5′-CACCGACCCCCCGAAGAA-3′用1、2引物进行PCR扩增，等位基因IA，IB产物为200bp，等位基因i(258位G缺失)产物为199bp。限制性内切酶kpnI：i基因PCR产物199bp切出171bp＋28bp，IA，IB基因PCR产物200bp没有该酶的切点依然是200bp。用3、4引物进行PCR扩增，等位基因IA、IB、i的产物均为159bp。限制性内切酶AluI：IB基因PCR产物159bp切出118bp＋41bp，IA、i基因PCR产物159bp没有该酶的切点依然是159bpkpnI（1，2引物产物）消化：A，B基因200bp：————————200O基因199bp:———————17128AluI消化(3,4引物产物):A，O基因159bp：————————159B基因159bp:———————118411，2引物产物kpnI3,4引物产物AlunIA200159B200118+41O171+28159二、实验用品PCR扩增仪、电泳仪和电泳槽、微型移液器、恒温水浴锅、凝胶成像系统等，离心管、PCR管、移液器枪头等蛋白酶K、TritonX-100、TKM液、10%SDS、DTT、饱和NaCl、95%冰乙醇、TE缓冲液、10×PCRbuffer、TaqDNAPolymerase、10×EasyTaqDNAPolymeraseBuffer、dNTP、KpnⅠ、10×BufferKpnⅠ（withBSA）、AluⅠ、10×BufferAluⅠ（withBSA）、DNAMarker三、实验内容与操作1.材料准备：收集志愿者带有毛囊的头发6~7根，用无水乙醇清洗、蒸馏水漂洗后，自然风干待用。每根头发取毛根0.5cm，剪为两段，分别放入至0.2mL离心管中（每管中的头发均取自同一个体）。2.DNA提取：DTT-TKM-TritonX-100抽提法每管样品加入200μLTKM液，混匀，加1滴TritonX-100，混匀，6000r/min离心5min，弃上清。将沉淀溶于40μLTKM液，加3μL10%SDS，4μL蛋白酶K（0.2g/L），8μLDTT（4mol/L），剧烈混匀，55℃水浴5min。加入15μL饱和NaCl（6mol/L），混匀，13000r/min离心5min。转移上清约40μL至另一管中，加2.5倍体积95%冰乙醇，-20℃，30min。13000r/min离心10min，弃上清，加75%冰乙醇洗1次，干燥，溶于100μLTE，-20℃保存。3.扩增反应：扩增程序：1.94℃预变性5min2.94℃变性50s，3.60℃退火30s，4.72℃延伸60s，5.72℃延伸10min6.4℃保温。35次循环4.酶切反应：置37℃酶切反应3h，65℃10min终止反应。5.电泳检测：将酶切产物在3％的琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色后观察结果并照相。四、注意事项五、作业与思考题给出实验结果并进行分析