第三章-发酵液预处理

微生物菌体及残存的固体培养基外，还有未被微生物完全利用的糖类、无机盐、蛋白质，以及微生物的各种代谢产物。发酵液成分目的分离菌体和其他悬浮颗粒，除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于提取和精制后继各工序的顺利进行。对于胞外产物，经预处理应尽可能使目的产物转移到液相，然后经固液分离除去固相；对于胞内产物，则应首先收集菌体或细胞，经细胞破碎后，目的产物进入液相，随后再将细胞碎片分离。方法选择一、发酵液过滤特性的改变①发酵产物浓度较低，大多为1％一10％，悬浮液中大部分是水；②悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；③固体粒子可压缩性大；④液相粘度大，大多为非牛顿型流体；⑤性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响。这些特性使得发酵液的过滤与分离相当困难。（一）微生物发酵液的特性（二）改善发酵液过滤特性的物理化学方法通过对发酵液进行适当的预处理，即可改善其流体性能，降低滤饼比阻，提高过滤与分离的速率。1.降低液体粘度：根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的粘度成反比，降低液体粘度可有效提高过滤速率。注意加热温度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。有加水稀释法和加热法pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH值可改善其过滤特性。氨基酸、蛋白质等电点的调节；在膜过滤中，发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过调整pH值改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染；细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个pH值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。主要有等电点沉淀法2.调整pH采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的分散状态，使其聚结成较大的颗粒，便于提高过滤速率。另外，还能有效地除去杂蛋白和固体杂质，提高滤液质量。3.凝聚与絮凝助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。悬浮液中大量的细微胶体粒子被吸附到助滤剂的表面上，改变了滤饼结构，降低了过滤阻力。4.加入助滤剂常用的助滤剂硅藻土、纤维素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等。最常用的是硅藻土，使用时，通常细粒用量为500g/m3；中等粒度用量为700g/m3；粗粒用量为700-1000g/m3。加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如CaSO4，AlPO4等。生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，且能使胶状物和悬浮物凝固，改善过滤性能；如发酵液中含有不溶性多糖物质，用酶将其转化为单糖，以提高过滤速率。如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025%的淀粉酶，搅拌30min后，再加2.5%硅藻土助滤剂，可提高过滤效率5倍。不影响目的产物，可消除发酵液中某些杂质对过滤的影响，提高过滤速率。5.加入反应剂：（三）凝聚与絮凝凝聚和絮凝技术能有效地改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使聚集起来，增大体积，以便于过滤，常用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理中。通常发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电引力的作用使溶液中带相反电荷的粒子（即正离子）被吸附在其周围，在界面上形成了双电层。但是这些正离子还受到使它们均匀分布开去的热运动的影响，具有离开胶粒表面的趋势，在这两种相反作用的影响下，双电层就分裂成两部分。在相距胶核表面约一个离子半径的Stern平面以内，正离子被紧密束缚在胶核表面，称为吸附层或紧密层；在stern平面以外，剩余的正离子则在溶液中扩散开去，距离越远，浓度越小，最后达到主体溶液的平均浓度，称为扩散层。这样就形成了扩散双电层的结构模型，如图所示。扩散双电层的结构模型图当胶粒在溶液中作相对运动时，总有一薄层液体随着它一起滑移，这一薄层，厚度比吸附层稍大，滑移面（剪切面）在图14－l中用波纹线表示。这三种电位中只有ζ电位能实际测得，所以可以认为是控制胶粒间电排斥作用的电位，用来表征双电层的特征。ζ＝4πqδ/DD—水的介电常数；q—胶体的电动电荷密度，即滑移面上的电荷密度；δ—扩散层的有效厚度，即为吸附层和扩散层界面处电位φd降低到其值为1/e处的距离，ζ电位与扩散层厚度δ和电动电荷密度q成正比，而扩散层厚度又与溶液中离子强度有关，当双电层的排斥力不足以抗衡胶粒间的范德华引力时，由于热运动的结果导致胶粒的互相碰撞而聚集起来。在发酵液中加入具有高价阳离子的电解质，能降低ζ电位和脱除胶粒表面的水化膜，就能导致胶粒间的凝聚作用。凝聚：指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象。凝聚值：使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度。反离子的价数越高，该值就越小，即凝聚能力越强。1、凝聚硫酸铝Al2(SO4)3•18H2O（明矾）；氯化铝AlCl3•6H2O;三氯化铁FeCl3;硫酸亚铁FeSO4·7H2O；石灰；ZnSO4；MgCO3阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+常用的凝聚剂电解质有：2、絮凝絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。絮凝剂：是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，它们具有长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括带电荷的阴离子或阳离子基团以及不带电荷的非离子型基团。它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架联结时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝作用。工业上使用的絮凝剂可分为三类：1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物；2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等；3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。目前最常见的高分子聚合物絮凝剂有机合成的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）类衍生物根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类：非离子型、阴离子型（含有羧基）阳离子型（含有胺基）1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物；2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等；3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。工业上使用的絮凝剂有机合成的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）类衍生物根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类：目前最常见的高分子聚合物絮凝剂非离子型阴离子型（含有羧基）阳离子型（含有胺基）用量少，一般以mg/L计量；絮凝体粗大，分离效果好；絮凝速度快；种类多，适用范围广。聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点医药和食品工业：聚丙烯酸类阴离子絮凝剂（无毒），聚苯乙烯类衍生物，无机高分子聚合物絮凝剂（聚合铝盐、聚合铁盐等），天然有机高分子絮凝剂（多聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等）。聚丙烯酰胺类絮凝剂的应用絮凝的效果与絮凝剂的加量、相对分子质量和类型、溶液的pH、搅拌转速和时间等因素有关。在絮凝过程中，常需加入一定量助凝剂以增加絮凝效果。较多的絮凝剂有助于增加桥架数量，但过多的添加量反而会引起吸附饱和，絮凝剂争夺胶粒而使絮凝团的粒径变小，絮凝效果下降。对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理；对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果，这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。3、混凝二、发酵液的相对纯化发酵液中杂质很多，其中有些杂质不仅直接影响产品质量利收得率，同时对后继提取和精制有很大影响。发酵液中的杂质（1）高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质的交换容量。在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力，在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清。在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤效率。因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。（2）杂蛋白1.Ca2+：草酸、草酸钠→形成草酸钙沉淀但草酸价格较贵，加入硫酸铅，在60℃下反应生成草酸铅。后者在90－95℃下用硫酸分解，经过滤、冷却、结晶后可以回收草酸。草酸镁的溶解度较大。故加入草酸不能除尽镁离子。要除去镁离子，可以加入三聚磷酸钠，它和镁离子形成可溶性络合物Na5P3O10＋Mg＋＋＝MgNa3P3O10＋2Na十2.Mg2+：三聚磷酸钠→形成三聚磷酸钠镁（可溶性络合物）3.Fe2+——黄血盐，→普鲁士兰沉淀（一）高价无机离子的去除方法蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。在酸性溶液中带正电荷；在碱性溶液中带负电荷。在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。（二）杂蛋白的去除方法在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，如Ag+、Cu++、Zn++、Fe+++和Pb++等形成沉淀。由于羧基的电离度比氨基大，故蛋白质的酸性性质通常强于碱性，因而很多蛋白质的等电点都在酸性范围内（pH4.0－5.5）。但单靠调节pH至等电点的办法不能将大部分蛋白质除去。1.酸碱调节，使蛋白质与盐或离子形成沉淀①加热，②大幅度调节pH值，③加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。不足之处:a.加热法只适合于对热较稳定的目的产物；极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合2.变性法加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。①在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质；②在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。3.吸附法三、固液分离工程及设备范围：培养基、发酵液、某些中间产品和半成品。其中发酵液由于种类多、粘度大和成分复杂，分离最为困难。方法：分离筛、重力沉降、浮选分离、离心分离和过滤等，其中用于发酵液固液分离的主要是离心分离和过滤分离。重力沉降浮选通气，产生气泡，使固体附着在气泡表面除去。用于固液比重差小、直径5～30μm颗粒的分离，污水处理旋液分离悬浮液以较高速度沿切线方向进入旋风分离器，轻相由分离器中央排出，重相由分离器下部排出，但不适合直径5μm颗粒去除（可用丝网分离器）。介质过滤霉菌和放线菌为丝状菌，体形较大，发酵液采用过滤方法；细菌和酵母菌为单细胞，体形较小，其发酵液采用高速离心分离，如对发酵液进行预处理，也可用过滤进行固液分离。离心工业上常用1.原理：利用转鼓高速转动所产生的离心力，来实现悬浮液、乳浊液的分离或浓缩。2.优点：分离速率快、分离效率高、液相澄清度好等。3.缺点：设备投资高、能耗大。此外，连续排料时，固相干度不如过滤设备。4.种类：种类多，按其作用原理不同，可分为过滤式离心机和沉降式离心机两大类。（一）离心分离5.离心机种类：a.碟片式离心机b.管式离心机C.倾析式离心机（二)过滤微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞碎片以及残余的固体培养基成分。过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒与液体进行分离的过程。在过滤操作中，要求滤速快、滤液澄清，并且有高的收率。1.原理：悬浮液通过过滤介质时，固态颗粒与溶液分离。2.类型：澄清过滤滤饼过滤过滤介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭、玻璃珠、塑料颗粒等。当悬浮液通过滤层时，固体颗粒被阻拦或吸附在滤层的颗粒上，使滤液得以澄清。适合于固体含量少于0.1g/100mL、颗粒直径在5-100um的悬浮液的过滤分离，如河水、麦芽汁、酒类和饮料等的澄清。（1）澄清过滤：过滤介质为滤布，包括天然或合成纤维织布、金属织布、玻璃纤维纸、合成纤维等无纺布。当悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布阻拦而逐渐形成滤饼（滤渣）。当滤饼至一定厚度时即起过滤作