荧光分析法

第1页教案首页教案完成时间：2006年1月课程名称仪器分析授课年级及专业药学2004级教学内容授课题目（章、节）第十二章荧光分析法教材名称《分析化学》（第五版），李发美主编，人民卫生出版社教材起止页码229~242计划学时3教学要求掌握内容1．荧光分析法的基本原理（荧光的产生、荧光光谱的特征）；2．荧光定量分析方法（荧光强度与物质浓度的关系、荧光定量分析条件及方法）；熟悉内容1．分子结构与荧光的关系；2．影响荧光强度的外界因素。了解内容1．荧光分析仪器；2．荧光分析新技术。教学要点重点荧光分析法的基本原理难点影响荧光强度的内外因素教学进程第一节荧光分析法的基本原理（1.5学时）第二节荧光定量分析方法（0.5学时）第三节荧光分光光度计和荧光分析新技术（1学时）教学方法采用多媒体教学方式，以教师课堂讲授为主，辅以提问、讨论等多种方式，部分内容学生课后自学。参考资料1．《分析化学》（第四版）下册，孙毓庆主编，人民卫生出版社2．湖南大学化学主干课程系列教材《分析化学》，张正奇主编，科学出版社3．北京大学化学科学译丛《分析化学》，R.KellnerJ.–M.MermetM.OttoH.M.Widmer等编著，北京大学出版社4．《仪器分析》（第二版），朱明华主编，高等教育出版社教研室审阅意见：______________（教研室主任签名）年月日第2页（教案续页）第8次课授课时间：2006年3月31日授课地点：第32教室教学主要内容教学要求、方法及时间分配第十二章荧光分析法计划学时数：3学时内容提要：本章属于发射光谱分析，主要介绍了荧光分析法的基本原理、定量分析方法及仪器与技术。概述[副板书]吸收某种波长的光后发射出比原来吸收波长更长的光的现象称为光致发光，最常见的光致发光现象是荧光和磷光。根据物质的分子荧光光谱进行定性分析，以荧光强度进行定量分析，这就是通常讲的荧光分析法。荧光根据分析对象分为原子荧光和分子荧光；根据激发光的波长范围又可分为紫外-可见荧光、红外荧光和X射线荧光（本章主要介绍分子紫外-可见荧光）。荧光分析法与UV-vis的主要区别在于：紫外-可见分析是利用紫外光照射物质后产生吸收，测其吸光度；而荧光是在透射光的垂直方向测发射荧光的强度，以免透射光干扰。简单的说，二者的区别主要在于光路不同。第一节基本原理计划学时数：1.5学时内容提要：本节介绍荧光分析法的基本原理，主要讲解荧光产生的原理、光谱特征、强度及其影响因素。本节为本章重点、难点。一、分子荧光的产生㈠荧光和磷光1．单重态与三重态通常在室温下，分子处于电子能级的基态（S0），电子成对地填充在能量最低的各个轨道上（P230图12-1A），根据Pauli不相容原理，这两个电子的自旋方向相反，自旋量子数分别为1/2和-1/2，总自旋量子数s=0，即基态没有净自旋，这样的分子放在磁场中就不会发生能级的分裂，这样的电子能级称为单重态（S），其多重性M=2s+1=1。[多媒体1：荧光分析法]（本章内容提要）[多媒体2：荧光分析法概述之概念及分类]（简单介绍荧光分析法的基本概念、分类、特点及应用等）[多媒体3：荧光分析法概述之与UV-vis的区别及仪器]（【掌握】荧光分析法与UV-vis的区别主要在于光路不同）[主板书][多媒体4：荧光分析法的基本原理]（本节内容提要）[主板书][多媒体5：单重态与三重态]（【熟悉】概念及区别）第3页（教案续页）第次课授课时间：授课地点：教学主要内容教学要求、方法及时间分配基态分子的成对电子吸收光能后，可被激发到高能级：若电子跃迁后，电子的自旋仍处于配对状态，自旋方向相反（s=0），这种情况称为激发单重态（M=2s+1=1）（P230图12-1B）；若电子跃迁后，发生自旋反转，自旋方向平行，总自旋量子s=1时，多重性M=2s+1=3，这样的电子能级称为三重态（T），这种情况称为激发三重态（P230图12-1C）。因为在两个未占满的电子轨道中，电子自旋不受Pauli不相容原理的限制，自旋方向可以相同。激发三重态的能量略低于相应激发单重态。2．荧光的产生处于激发态的分子返回基态的几种途径：图中S0表示分子的基态，S1*表示第一电子激发单重态，S2*表示第二电子激发单重态，T1*表示第一电子激发三重态。⑴振动弛豫激发态的分子在很短时间内（约10-12秒），通过与溶剂分子间的碰撞，将过剩的振动能量以非辐射的形式传递给溶剂分子，释放振动能量后，从较高的振动能级下降至同一电子激发态的最低振动能级上，这一过程叫振动弛豫（P230图12-2b），属于无辐射跃迁。S1*(V=1,2,3……)→S1*(V=0)S2*(V=1,2,3……)→S2*(V=0)⑵内部能量转换如果受激分子以无辐射跃迁方式从较高电子能级的较低振动能级转移至较低电子能级的较高振动能级上，这个过程叫内部能量转换，简称内转换。内转换在激发态与基态之间不易发生，而在两电子激发态能级非常靠近以至其振动能级有重迭，能量相差较小时容易发生。[主板书][多媒体6：激发态→基态途径（图）]（本章重点、难点）[多媒体7：激发态分子返回基态的途径]（【掌握】六种途径，【熟悉】基本概念）[主板书][多媒体8]（强调两点：同一电子能级和无辐射跃迁）[主板书][多媒体8：激发态分子返回基态的途径之内转换]第4页（教案续页）第次课授课时间：授课地点：教学主要内容教学要求、方法及时间分配⑶荧光发射当激发分子通过振动弛豫达到第一电子激发单重态的最低振动能级后，再以辐射形式发射光量子而返回至基态的各个振动能级时，所发射的光量子即为荧光。荧光：S1*(V=0)→S0(V=1,2,3……)由于振动弛豫和内转换损失了部分能量，荧光的能量小于原来吸收紫外光（激发光）的能量，所以发射的荧光波长总比激发光波长更长。⑷外部能量转换如果溶液中激发分子通过碰撞将能量转移给溶剂分子或其它溶质分子（常以热能的形式放出），而直接回到基态的过程叫作外部能量转换，简称外转换。⑸体系间跨越处于激发单重态较低振动能级的分子有可能发生电子自旋反转而使分子的多重性发生变化，经过一个无辐射跃迁转移至激发三重态的较高振动能级上，这一过程称为体系间跨越。分子中有重原子（I或Br），由于自旋-轨道的强偶合作用，电子自旋可以逆转方向，发生体系间跨越从而使荧光减弱。⑹磷光的产生受激分子经激发单重态到三重态体系间跨越后，很快发生振动弛豫，到达激发三重态的最低振动能级，分子在三重态的寿命较长（10-4~10S），所以可延迟一段时间，然后以辐射跃迁返回基态的各个振动能级，这个过程所发射的光即为磷光。S1*体系间跨越T1*(V=1,2,3……)振动弛豫T1*(V=0)辐射S0(V=1,2,3……)荧光和磷光的主要区别在于：就发光机制而言，荧光是由单重态→单重态的跃迁产生的；而磷光是由三重态→单重态的跃迁产生的；如用实验现象加以区别，对荧光来说，当激发光停止照射时，发光过程随之消失（10-9~10-6秒）；而磷光则将延续一段时间（10-3~10秒）。磷光的能量比荧光小（因三重态的能量比单重态的低），波长较长，发光的时间也较长。㈡激发光谱与荧光光谱（荧光物质分子的两个特征光谱）由光源发出的紫外光，通过激发分光系统分光后照射到样品，样品受激发射荧光，在垂直方向检测荧光信号，以免透射光的干扰。这部分荧光再通过发射分光系统后进入检测器。激发光谱就是将激发荧光的光源用激发分光系统I分光，测定每一激发波长所发射的荧光强度，然后用F~λex作图。使激发光的波长和强度不变，而让物质所产生的荧光通过发射分光系统II分光，测定每一发射波长荧光强度F，以F~λem作图，得到的就是荧光光谱。[多媒体8]（本章重点，【掌握】荧光的概念及产生原理，强调从第一电子激发单重态最低振动能级）[多媒体9]（与荧光、磷光对比）[主板书][多媒体9][主板书][多媒体9]（与荧光对比讲解）[多媒体10：荧光与磷光的主要区别]（要求【掌握】，从两个方面讲解）[主板书][多媒体11：激发光谱与荧光光谱]（【掌握】概念及用途）第5页（教案续页）第次课授课时间：授课地点：教学主要内容教学要求、方法及时间分配溶液荧光光谱通常具有如下特征：1．斯托克斯位移荧光发射波长总是大于激发波长的现象。产生斯托克斯位移的原因，是因为分子受激时可能被激发到各级电子激发态的各个振动能级，而发射荧光时，总是从第一激发态的最低振动能级回到基态，有一部分能量损失。2．荧光光谱的形状与激发波长无关因为分子受激时，可能被激发到第一激发态或第二、三激发态，而发射荧光时，只能从第一激发态最低振动能级回到基态的各个振动能级3．荧光光谱与激发光谱的镜像关系因为电子从基态跃迁至激发态时，可跃迁至激发态的各个振动能级，而引起的这些小峰，而荧光光谱是从第一激发态的最低振动能级跃迁至基态各个振动能级。两个能级的振动能级相似，所以在激发光谱中跃迁能量最小的与荧光光谱中发射能量最大的相对应，激发光谱是以S0(V=0)→S1*(V=1,2,3,4)，荧光光谱是以S1*(V=0)→S0(V=1,2,3,4)。由于荧光能量小在长波段，激发光谱能量大在短波段，所以它们之间形成镜像。二、荧光与分子结构㈠荧光寿命和荧光效率（荧光物质的两个重要发光参数）1．荧光寿命(τf)荧光寿命是指当激发光停止照射时，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1/e所需的时间。当荧光物质受到一个极其短暂的光脉冲激发后，它从激发态到基态的变化可用指数衰减定律表示：Ft=F0e-KτF0和Ft分别是在激发时t=0和激发后时间t时的荧光强度，K是衰减常数。假定t=τf时，测得Ft=(1/e)F0：ffKKKKeeeFeFff/11/1/00则ftKtttFFeFF00ln/如果以Ft/F0~t作图，直线斜率为1/τf，由此可计算荧光寿命。利用分子荧寿命的差别，可以进行荧光物质混合物的分析。2．荧光效率(荧光量子产率，φf)指物质发射荧光的量子数与吸收激发光的量子数之比。φf=发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数这个数字在0~1之间，其数值越大，荧光效率越高。[主板书][多媒体13]（【掌握】荧光光谱的三个特征，从荧光产生的原理加以讨论）[主板书]（影响荧光强度的内部因素）[多媒体16：荧光寿命和荧光效率]（【熟悉】概念）[主板书][多媒体17：荧光寿命和荧光效率]（【熟悉】概念）第6页（教案续页）第次课授课时间：授课地点：教学主要内容教学要求、方法及时间分配㈡分子结构与荧光的关系物质分子能发射荧光的两个必要条件是：①有强的紫外-可见吸收；②有一定的荧光效率。1．长共轭结构具有长共轭结构的分子都是一些芳香环、稠环或杂环的物质。这类物质有利于荧光的发射，因为它们的共平面性大，π电子共轭程度也大，荧光效率就大。所以共轭系统越长，荧光效率越大，激发波长、荧光波长长移。例如：λex（激发）λem（激发）φf苯2052780.11萘2863210.29蒽365400046四苯3904800.60另外稠芳环分子排列的几何形状对荧光也有影响，比如蒽和菲都是三个苯环组成，蒽的荧光波长为400nm，菲的为350nm；又如四苯为480nm，苯并蒽为380nm。蒽菲苯并蒽另外，含有长共轭双键的脂肪烃也可能有荧光，但这类化合物为数不多。CH2OCOCH3VAλex=327nmλem=510nm2．分子的刚性和共平面性在共轭系统中，分子的刚性和共平面性越大，越有利于荧光发射。联苯φf=0.2芴φf=1.0NOHNOMg1/28-羟基喹啉8-羟基喹啉镁[主板书]（【熟悉】分子结构对荧光强度的影响）[多媒体18：物质分子发射荧光的条件]（【掌握】荧光产生的两个必要条件）OOCOO--O荧光素钠第7页（教案续页）第次课授课时间：授课地点：教学主要内容教学要求、方法及时间分配SO3NaNCH3CH3NNaO3SH3CCH31-二甲氨基萘-7-磺酸盐1-二甲氨基萘-8-磺酸盐φf=0.75φf=0.03对于顺反结构，顺式共面性差，反式共面性好，如1，2-二苯乙烯几乎无荧光，反式有荧光。3．取代基⑴供电子基：