微生物学实验教学大纲

1课程编号：《微生物学实验》教学大纲学时数：108讲课：108学制：四年制本科适合专业：生物科学相关专业一、本课程的性质和任务（一）课程的性质：微生物学实验主要任务是使学生掌握研究与应用微生物的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术，使学生具有适应于从事相关学科的基础理论研究与实际生产应用的微生物学实验技能。提高学生分析问题和解决问题的能力。根据本学科的特点，逐步使学生认识微生物的基本特性，比较它们与其它生物的相似和不同之处，知道如何研究微生物以及对研究中所出现的问题点样分析，并加以解决。（二）课程的任务：微生物学实验是生物学重要的基础课之一，要求学生熟悉微生物学方法与技术，掌握无菌操作技能和建立无菌概念是微生物学实验中最重要的内容，重点掌握最基本的无菌操作技能，如接种、纯培养、计数等。二、本课程与其他课程的联系：1.通过教师示范、讲解与学生实际操作相结合方法，使学生牢固树立无菌概念，掌握显微镜的使用、生物染色技术、形态学观察的方法、微生物计数、培养基的配置和灭菌方法、微生物分离、纯化等基本操作技能，基本了解常用的仪器设备的基本原理、构造、使用方法及使用中的注意事项，树立严谨求实的科学态度，提高观察、分析问题和解决问题的能力，培养勤俭节约、爱护公物和相互协作的优良作风。2.本实验课内容包括验证性实验、综合性实验两个部分。验证性实验主要2通过光学显微镜镜检观察方法进行教学，综合实验在教师指导下学生根据所掌握的理论基础和实验技能，由学生自己动手完成。实验过程要求学生仔细观察实验现象，完整记录原始实验数据、结果，分析实验现象并认真填写实验报告。三、教学内容（一）实验一实验室安全教育与微生物学实验室常用的器皿目的要求掌握实验室安全规则，了解微生物学实验所用的器皿，因其大多要进行消毒、灭菌和用来培养微生物，因此了解其质量、洗涤和包装方法的要求。实验内容一、器皿的种类、要求与应用：1、试管大试管(约18mm×180mm):可装倒平板用的培养基；可作制备斜面用；装液体培养基用于微生物的振荡培养中试管[(13～15)mm×(100～150)mm]:装液体培养基培养细菌或做斜面用；用于细菌、霉菌、病毒等的稀释和血清学试验。小试管[(10～12)mm×100mm]:一般用于糖发酵或血清学试验，和其它需要节省材料的试验。2、容量瓶主要用于准确配制一定浓度的溶液，它是一种细长颈、梨形的平底玻璃瓶，配有磨口塞，瓶颈上刻有标线。3、量筒用来量取液体体积的一种玻璃仪器，外壁上有刻度。常用量筒的规格有5ml、10ml、25ml、50ml、100ml、250ml等。4、三角瓶用来装无菌水、培养基和振荡培养微生物等。5、烧杯呈圆柱形，顶部的一侧开有一个槽口，便于倾倒液体，有些烧杯外壁标有刻度，可以粗略地估计烧杯中液体的体积，这种烧杯叫印标烧杯，也叫刻度烧杯，其分度并不十分精确，允许误差一般在±5%。6、烧瓶3通常具有圆肚细颈的外观，因瓶口很窄，不适用玻璃棒搅拌，若需要搅拌时，可以手握瓶口轻微转动手腕即可顺利搅拌混匀。烧瓶随其外观的不同分为圆底烧瓶和平底烧瓶两种，通常平底烧瓶用在室温下的反应，而圆底烧瓶则用在较高温的反应，这是因为圆底烧瓶的玻璃厚薄较均匀，可承受较大的温度变化。7、三角烧瓶（锥形瓶）锥形瓶瓶体较长，底大而口小，盛入溶液后，重心靠下，极便于手持振荡，故常用于容量分析中作滴定容器。也可以供加热、煮沸、贮存、消毒各种液体用，常用容量有：100ml、250ml、500ml、1000ml等。8、烧杯用来配制培养基与各种溶液等。9、离心管常用的有0.5ml、1.5ml、10ml、15ml、20ml等规格，其上有刻度，专供离心机使用。主要用于微生物分子生物学实验中，小量菌体的离心，DNA或RNA的检测和提取等。10、移液管和吸管均用于吸取和转移少量液体。移液管上刻有标线，在标明的温度下，当吸取溶液至弯月面与标线相切后，让溶液自然放出，此时所放出溶液的体积即等于管上所标的体积。常用的移液管有1mL、2mL、5mL、1OmL等。吸管常用的规格有两种：一种为无刻度的毛细管；另一种为有刻度吸管，管壁有精细的刻度。一般长为25cm，常用的容量为0.2mL、0.5mL、1mL、2mL、5mL、1OmL。11、染色缸有方形和圆形两种，方形的较大，可放10张载玻片，圆形的较小，可放5张载玻片，供细菌、血液及组织切片的标本染色用。12、漏斗分短颈和长颈式两种。漏斗直径大小不等，有60mm、100mm和150mm等几种不同规格，供分装溶液或者上垫滤纸、纱布、棉花作过滤杂质用。13、滴瓶有橡皮帽式和玻塞式，分无色和棕色，容量有30mL和60mL等，供储存试剂或染色液用。14、下口瓶分为有龙头和无龙头两种。容量有2500mL、5000mL两种规格。供存放蒸馏水或常用的消毒药液用。15、培养皿由一底一盖组成一套，常用的培养皿皿底直径90mm，高15mm,皿底皿盖均4为玻璃制成。在培养皿内倒入适量固体培养基制成平板，可用于分离、纯化、鉴定菌种、活菌计数以及测定抗生素、噬菌体的效价等。16、载玻片及盖玻片载玻片主要用于微生物涂片、染色，做形态观察等。另有凹玻片，就是在一块厚玻片当中有一圆形凹窝，做悬滴观察活细菌及血清学试验用。盖玻片为极薄的玻片，用于标本封闭及悬滴标本等。17、德汉氏小管观察细菌在糖发酵培养基内产气情况时，一般在小试管内再套一倒置的小套管（约6mm×36mm），此小管即为德汉氏小管，又称发酵小套管。18、双层瓶由内外两个玻璃瓶组成，内层小锥形瓶放香柏油，供油镜观察微生物时使用，外层瓶放二甲苯，用以擦净油镜头。19、接种工具接种工具有接种环，接种针，接种钩，接种铲，玻璃涂布器等。为细菌学检验工作中接种、分离细菌或挑取菌落制作涂片所必不可少的工具。接种环常装于铝质的握柄上，用坏后可随时更换。二、玻璃器皿的洗涤方法1、新玻璃器皿的洗涤在2%的盐酸溶液中浸泡数小时，用自来水冲洗干净。2、旧玻璃器皿的洗涤（1）试管、培养皿、三角瓶：洗衣粉和去污粉洗刷，自来水冲洗。A装有固体培养基：刮掉，洗涤。B带菌的器皿：2%来苏尔或0.25%新洁尔灭消毒液中浸泡24小时或煮沸0.5小时，然后洗涤。C带病原菌培养物的器皿：先高压蒸汽灭菌，倒去培养物。（2）玻璃吸管：吸管尖端与装在水龙头上的橡皮管连接，反复冲洗。A吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸管：立即投入盛有自来水的容器中浸泡，实验后集中冲洗。B塞有棉花的吸管：用水将棉花冲出，然后冲洗。C吸过含有微生物培养物的吸管：2%来苏尔或0.25%新洁尔灭消毒液中浸泡24小时然后洗。D吸管内壁有油垢：洗涤液中浸泡数小时，再冲洗。洗净后的试管倒置于试管筐内，三角瓶倒置于洗涤架上，培养皿的皿底和皿盖分开，依次压着皿边排列倒扣在桌上,晾干。5洗涤后，若内壁的水均匀分布成一薄层，表示完全洗净，若还挂有水珠，则需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水冲洗。三、各种器皿的包扎1、培养皿的包扎：培养皿常用旧报纸紧紧包裹（也可用金属筒包装），一包7～10套，包好后干热或湿热灭菌。2、吸管的包扎：在上端约0.5cm处，塞入一小段1.5cm长的棉花（勿用脱脂棉），目的是避免将外界或嘴中杂菌吹入管内，或不慎将菌液吸出管外。然后用4～5cm宽的长纸条包扎。3、试管和三角瓶等的包扎：试管口和三角瓶瓶口塞棉花塞或硅胶塞；用二层报纸包扎好（如有牛皮纸，效果更好），进行干热或湿热灭菌。试管较多时，一般7个或10个一组，再用双层报纸包扎。附：棉塞的制作：棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基水份的蒸发，故在微生物工作中一直普遍使用着。做棉塞的要求：松紧适中，不能太松也不能太紧，太松达不到滤菌的目的，并且易脱落，太紧通气不好，操作不便，做到手拿不掉，又易转动；深浅适度，棉塞总长1.5寸左右，约有1/3在试管外，2/3在试管内，顺时针方向塞入。棉花要求采用普通棉花，它能防潮不易吸水，不要用脱脂药棉，它易吸水又昂贵。（由教师示范）实验材料和用品以上所有器皿。（二）实验二环境微生物的检查目的要求1、证明实验室环境与体表存在微生物；2、比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型；3、观察不同类群微生物的菌落形态特征；4、体会无菌操作的重要性。实验原理平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在合宜温度下培养，1-2d内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进6行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。实验内容1、环境微生物的检测：倒平板、接种环境微生物；2、灭菌器皿的准备：学习包扎平皿、移液管。实验材料和用品1、材料：环境中各种微生物；2、用品：牛肉膏蛋白胨培养基、无菌平皿、移液管、平皿、酒精灯、牛皮纸、记号笔。（三）实验三显微镜的构造、性能和使用方法目的要求1、学习掌握油镜的规范使用方法；2、复习掌握光学显微镜的基本结构及使用方法。实验原理油镜工作原理：1、增加照明亮度；2、显微镜的分辨力：指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与接物镜的数值孔径成正比，与光的波长成反比。分辨力=（1/2光波长度）/数值孔径实验内容1、复习显微镜的使用方法；2、油镜的使用原理、操作要点（包括清洁方法）；3、当堂考核油镜使用方法，合格方能通过。实验材料和用品学生显微镜、细菌三型装片；双层瓶(内装香柏油和乙醚——酒精擦拭液)、擦镜纸。（四）实验四细菌的简单染色与显微观察目的要求1、学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法；72、初步认识细菌的个体形态、菌落形态特征；3、巩固显微镜(油镜)的使用方法和无菌操作技术。实验原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷(酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷)，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。实验内容1、微生物菌落形态的观察：几种代表类型微生物菌落形态特征了解、辨识；2、细菌简单染色及个体形态的观察：无菌接种操作；涂片、干燥、固定、染色、水洗、干燥、镜检。实验材料和用品1、材料：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、环境微生物检测平板；2、用品：学生显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶(内装香柏油和乙醚——酒精擦拭液)、擦镜纸；吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)。（五）实验五革兰氏染色目的要求1、学习并初步掌握革兰氏染色法；2、了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。实验原理革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法，是1884年由丹麦病理学家ChristainGram氏创立的，而后一些学者在此基础上作了某些改进。该染色法能将细菌分为G－菌和G＋菌，是基于这两类细菌的细胞壁结构和成分不同。G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G＋菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。8实验内容1、革兰氏染色法基本步骤：制片→初染→媒染→脱色→复染→镜检；2、染色成败原因分析；3、实验操作考核一。实验材料和用品1、材料：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌；2、用品：学生显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶(内装香柏油和乙醚——