6.2-DNA片段的扩增——PCR技术-课件(中图版选修1)

课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测第二节DNA片段的扩增——PCR技术课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测尝试PCR技术的基本操作和应用。1．简述PCR技术的原理和用途。2．简述PCR技术的基本操作步骤。3．进行DNA片段的PCR扩增。课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测(1)解旋在_______的作用下解开DNA双链。(2)合成引物在____________的作用下，以_________为模板，合成一段RNA引物。PCR的原理和过程1．DNA的复制解旋酶RNA聚合酶DNA单链课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测(3)合成子链以_________为起点，在___________的作用下，以_______________为原料，按照______________原则合成两条新的DNA子链。(1)PCR的定义DNA体外扩增技术实际上是在体外模拟___________________过程，形成大量_________________，这个反应过程称为_______________，简称PCR。(2)PCR与DNA复制的不同点2．PCR技术RNA引物DNA聚合酶四种脱碱基互补配对细胞内的DNA复特异性的DNA片段聚合酶链式反应氧核苷酸制课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测PCRDNA复制引物人工合成的__________或RNA，其长度通常为___________________RNA解旋通过对_______________来实现的解旋酶(1)准备：将PCR缓冲液、_________、_________、四种脱氧核苷酸、___________、Mg2＋等成分加到一个特制的离心管中；(2)高温变性：把离心管置于____℃的环境中，使DNA碱基对之间的_____断裂，形成_____单链，这个过程称为高温变性；DNA单链20～30个脱氧核苷酸反应温度的控制3.PCR的过程DNA模板一对引物DNA聚合酶95氢键两条课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测(3)低温复性：再将离心管置于___℃的环境中，使__________分别结合到两条分开的模板链上，这个过程称为低温复性；(4)中温延伸：最后将离心管置于___℃的环境中，在___________的催化下，游离的脱氧核苷酸从引物的一端一个一个地连接上去，形成两条新的_____，这个过程称为中温延伸。在1～2h内重复_______次循环，DNA片段数可增至_________倍。4．PCR的结果55一对引72DNA子链25～30106～物聚合酶107课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测为什么DNA复制必须有引物？提示DNA聚合酶不能从头合成DNA，而只能以3′延伸DNA链，故DNA合成时，必须加入引物(其3′游离)以作为延长DNA子链的“引子”。[思维激活1]课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测(1)PCR原理①PCR原理：DNA分子在一定条件下可以进行半保留复制。②DNA的热变性原理：在80～100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性；当温度缓慢下降后，两条被分离的DNA链又会重新结合成双链，这个过程称为复性。双链DNA80～100℃变性温度缓慢降低复性DNA单链1．PCR的原理课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测(2)PCR扩增方向①3′端和5′端：为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(—OH)末端称为3′端，而含磷酸基团的末端称为5′端；一个双链DNA分子中含两个3′端和两个5′端，如果一条链的方向是3′→5′，则另一条链的方向就是5′→3′，这就是反向平行的含义。②DNA分子中相邻两个脱氧核苷酸残基通过3′，5′磷酸二酯键相连，该化学键是由一分子脱氧核苷酸中3号碳原子上的羟基(—OH)，与相邻的另一分子脱氧核苷酸中5号碳原子上的磷酸基团脱水聚合而成。所以DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测(1)PCR的反应条件①稳定的缓冲液环境；②DNA模板；③分别与模板DNA两条模板链相结合的两种引物；④四种游离的脱氧核苷酸；⑤耐热的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶；⑥能严格控制温度变化的温控设备。(2)PCR过程①高温变性当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。2．PCR的过程课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测②低温复性温度下降到55℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，形成局部双链。③中温延伸温度上升到72℃左右，在TaqDNA聚合酶的作用下，以四种脱氧核苷酸为原料，根据碱基互补配对原则，从引物的5′端→3′端延伸合成与模板互补的DNA链。课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测(1)PCR的每一轮循环包括高温变性、低温复性、中温延伸三步，从第二轮循环开始，每次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的DNA序列呈指数扩增。(2)PCR一般要经历三十多次循环，处于两引物间固定长度的序列数目为230。3．PCR的结果课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测下列有关PCR技术的叙述不正确的是()。A．聚合酶链式反应是一种体外迅速扩增DNA片段的技术B．在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似C．PCR反应只需在一定的缓冲溶液中提供DNA模板以及四种脱氧核苷酸D．PCR一般经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性、延伸【巩固1】课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测解析PCR是聚合酶链式反应的简称，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，也需要提供模板(母链)、酶、原料、能量等条件。PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为变性、复性和延伸三步。答案C课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测先用___________在___________中依次加入各组分：_________、耐高温的___________、脱氧核苷酸贮备液、___________、_____。第一次循环：___℃预变性5min→___℃复性1min→___℃延伸1min；重复30次：___℃变性30s→___℃复性30s→___℃延伸1min；最后一次循环：___℃延伸7min，反应产物在___℃保存。PCR技术的实验操作1．PCR扩增前的准备2．PCR扩增循环微量取样器微量离心管模板DNA聚合酶PCR缓冲液引物DNA955572955572724课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测PCR操作中模板DNA是否需解旋？需要解旋酶吗？提示PCR操作中，模板DNA仍需解旋，但该解旋过程不是解旋酶催化的结果，而是利用DNA热变性的原理，在80～100℃温度范围内，DNA双螺旋结构将解体，双链分开，以此达到解旋的目的。[思维激活2]课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测1．PCR扩增前的准备移液用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分：模板DNA、耐高温DNA聚合酶、脱氧核苷酸贮备液、PCR缓冲液、引物混合盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁，使反应液混合均匀离心将微量离心管放在离心机上，离心约10s，目的是使反应液集中在离心管底部反应：将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测PCR仪自动化程度较高，参照下表设计程序即可。循环数变性复性延伸保存第1次95℃，5min55℃，1min72℃，1min—重复30次95℃，30s55℃，30s72℃，1min—最后一次————72℃，7min4℃2．PCR热循环程序的设置课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测若无PCR仪，可用恒温水浴锅代替。三个恒温水浴锅的温度分别为94℃、55℃和72℃，然后按照上表要求，在三个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。(1)检测PCR扩增效果的原因3．检测PCR扩增效果课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测理论上DNA扩增呈指数增长，即一条DNA片段循环n次后的数目为2n，但实际可能会有诸多因素影响DNA含量，所以需要对DNA含量进行测定。(2)原理DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关，可以利用DNA这一特点进行DNA含量的测定。课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测(3)检测过程①10倍稀释：10μLPCR反应液，加入90μL蒸馏水，即将样品进行10倍稀释。②对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。③测定：取DNA稀释液加入到厚度为1cm的比色杯中，测定260nm处的光吸收值。④计算：DNA含量(μg/mL)＝（260nm的读数）0.02×稀释倍数。课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测有关下列操作过程的叙述，错误的是()。A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化D．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换【巩固2】课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测解析为了防止外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌；所用的缓冲液及酶应分装成小份保存，并使用一次性枪头，即A、B、D正确。在冰箱中放置的缓冲液和酶从冰箱中取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化，即C错误。答案C课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测美国科学家穆里斯发明了PCR技术。PCR技术是一种DNA分子“复印机”，它可以在数小时内将一个DNA分子复制出1千亿个，解决了检测样本扩增的难题。在人类基因组计划实施中，RCR技术使每个核苷酸的识别成本降低至5～10美元。穆里斯因发明PCR技术而荣获了诺贝尔奖。(1)DNA复制时需要大量的________作原料，在DNA聚合酶的催化下以解旋后的单链为________进行生物合成。【例1】示例一PCR的原理课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测(2)在DNA分子解旋时必须加热，普通的酶容易________，莫里斯从温泉中找到了耐95℃高温的________，解决了酶重复使用的难题，使链式反应成为可能。每次循环可分为________、________、________三步。思维导图：课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测深度剖析DNA复制的模板是DNA分子的每一条链，并以脱氧核苷酸为原料，在DNA聚合酶的作用下进行复制。由于在体外打开双螺旋结构，需要加热处理，因此，选用的DNA聚合酶必须能耐高温。答案(1)脱氧核苷酸模板(2)变性(失活)TaqDNA聚合酶高温变性低温复性中温延伸课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测方法技巧PCR技术特点：①PCR不需要解旋酶，而生物体内DNA复制时需要解旋酶；②PCR需要耐热的DNA聚合酶即TaqDNA聚合酶，而生物体内DNA聚合酶在高温时会变性；③PCR一般需经三十多次循环，而生物体内DNA复制需要生物体自身的控制。课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测使用PCR仪具体实验操作顺序应为()。①设计好PCR仪的循环程序②按配方准备好各组分③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分④进行PCR反应⑤离心使反应液集中在离心管底部A．②③⑤④①B．①⑤③②④C．②③⑤①④D．④②⑤③①思维导图：【例2】示例二PCR技术实验操作课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测深度剖析PCR反应的操作步骤一般分为准备(包括配制配方及将各配方放于实验台上)―→移液―→混合―→离心―→反应。因PCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。答案C课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测方法技巧PCR技术操作注意事项①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。②在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后