2.3-目的基因的获得

第三节目的基因的获得基因组文库法cDNA文库法PCR法化学合成法一、基因组文库法把某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌克隆子群体中，这个群体即为这种生物的基因组文库。1、将基因组随机酶切（Sau3A）成较大的DNA片段（10~30Kb)；2、连接适当载体（λ噬菌体载体、cosmid等）；3、转化受体菌（E.coli)，挑选克隆子构建基因组文库。基因组文库构建程序载体与基因组DNA大片段的连接①粘性末端直接连接载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A与BamHI的酶切末端。直接连接、人工接头或同聚物加尾②人工接头法人工合成的限制性内切酶粘性末端片断各种酶的接头可以向公司定做或购买接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶粘性末端③同聚物加尾基因组文库经验公式：N=ln（1-P）/ln（1-f）N：基因组文库必需的克隆子数；P：文库中目的出现的概率（期望值：90%or99%）f：克隆的DNA片段大小与基因组大小的比值。人的单倍体DNA总长为2.9x109bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15kb，则构建一个期望值为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当期望值提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆。举例：从基因库中筛选目的基因利用探针筛选利用目的基因的翻译产物筛选二、cDNA文库法cDNA文库的定义：某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌克隆子群体之中，这样的群体称为cDNA文库。部分cDNA文库构建cDNA文库比构建基因组文库困难cDNA和基因组文库的区别三、PCR法使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或目的基因两侧的序列，根据该序列合成PCR引物进行扩增。PCR扩增时，常常在引物5’端加入限制性内切酶位点，以方便后期连接载体四、化学合成法合成基因（基因较小）合成引物合成探针化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知。第四节基因工程的操作过程一、载体的选择1、依据实验目的选择载体2、依据受体细胞选择载体二、基因与载体连接1、粘性末端的连接：(1)单酶切连接(2)双酶切连接BamHⅠ切割反应GGATCCCCTAGGT4DNA连接酶16ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体DNA用BamHⅠ切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG目的基因自连载体自连单酶切连接双酶切连接为何要用双酶切？防止目的基因自连和载体自连控制目的基因的连接方向2、平末端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平末端、粘性末端补齐或切平形成的平末端目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连3、TA克隆一般情况下，TaqDNA聚合酶同时具有的末端转移酶的功能，在PCR反应时会在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个A，这样的PCR产物可以直接与T-载体连接。5’-GTACGGTTCCAGTCA-3‘3’-ACATGCCAAGGTCAG-5’5’-GTACGGTTCCAGTCA-3‘3’-ACATGCCAAGGTCAG-5’连接PCR产物三、重组DNA导入受体细胞（一）大肠杆菌转化1、大肠杆菌感受态的制备（1）目的增加受体菌细胞膜的通透性。（2）制备原理用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。原理：Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞变为感受态细胞。（3）制备过程培养大肠杆菌OD600至0.4~0.6冰上冷却菌体4℃离心收集菌体用冰冷的0.01MCaCl2重悬4℃离心收集菌分装、-70℃冻存用冰冷的0.01MCaCl2重悬（4）转化——热休克法（heatshock）50ng载体DNA100L感受态菌混合，冰浴30分钟42ºC90s加入800LLB培养基37℃培养50min离心，取菌体悬液涂布筛选平板冰浴2min10-100L转化液涂于含抗菌素的平板37℃过夜（二）其他方法1、电穿孔转化法利用高压电脉冲作用，使细胞膜上产生可逆的瞬间通道，可将外源DNA导入细菌和真核细胞。电穿孔转化法比热休克法转化细菌效率高，1μgDNA可以得到109~1010个转化子；热休克法1μgDNA可以得到106~108个转化子。LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，2℃离心集菌冰冷的水重悬菌体2℃离心集菌冰冷的水重悬菌体2℃离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成50-300L电转仪调为2.5kV,25F脉冲控制器200-4000.5g质粒DNAOnice混合加入1mLSOC培养液37℃中速震荡60分钟10-100L转化液涂含抗菌素的平板转化电转化法2、原生质体融合通过带有外源DNA的细菌原生质体同培养的动物细胞直接融合。经过细胞膜融合，细菌内容物能转入动物细胞中，DNA被转移到细胞核中。3、脂质体法脂质体是由磷脂双分子层组成的人工膜状结构，将DNA包裹于脂质体微囊中，并通过脂质体与原生质体的融合或原生质体的吞噬过程，将外源DNA导入。脂质体4、体内注射转化法利用显微注射仪把外源DNA直接注入细胞的转基因方法，可用于动植物的外源DNA的转化。本方法操作繁琐，但转化效率较高。四、克隆子的筛选与鉴定(一)克隆子的筛选通常将摄取外源DNA分子并在其中稳定维持的受体细胞统称为克隆子根据载体标记基因筛选根据报告基因筛选根据载体标记筛选抗生素抗性标记筛选（pBR322）根据LacZ’基因互补显色筛选根据载体除草剂抗性基因筛选（植物细胞）根据宿主基因缺陷互补进行筛选根据报告基因筛选绿色荧光蛋白（GFP）与外源基因共表达（二）克隆子的鉴定DNA水平转录水平翻译水平1、DNA水平（1）酶切鉴定克隆子质粒提取酶切电泳质粒片段外源基因(2)PCR鉴定克隆子质粒提取以质粒为模版进行PCR电泳分析引物按照外源基因序列或质粒序列设计（3）Southern印记杂交——Southernblot菌落原位杂交2、转录水平NorthernblotRT-PCRNorthernblotting用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。主要检测插入片断是否被转录。从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。3、翻译水平1）酶联免疫吸附测定（ELISA）Enzyme-linkedimmunosorbantassay（1）原理：一抗：与目标分子的特异结合。二抗：与一抗的特异性结合。酶连：二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。待测基因产物蛋白一抗二抗酶待测基因产物蛋白一抗二抗无色的底物有色的产物比色观察酶（2）ELISA检测的一般步骤A固定样品将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiterplate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。孔底加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。B一抗结合一抗加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。C二抗结合二抗加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。D显色反应在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。E比色2）免疫印迹（westernblot）法1.原理：在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质变成棒状分子，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。①SDS:（SDS-PAGE）：②聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：（Polyacrylamidegelelectrophoresis）在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。③蛋白质电泳的分子量标准已知分子量的蛋白质混合液。Da道尔顿(质量单位,等于一氧原子质量的十六分之一。一克约为6×1023道尔顿氨基酸平均分子量：110Da④凝胶中的蛋白质染色：考马斯亮蓝：灵敏度低、只能检出0.3-1μg/带，但可褪色回收。硝酸银：灵敏度高、可检出2-5ng/带。2）转到膜上进行染色1）直接染色银染（2）Western转膜装置用放射性同位素或非放射性标记物标记特异性抗体。将转膜的印迹上的抗原与抗体反应，在杂交膜上显示出明显的杂交信号，则表明受体细胞中存在目的基因表达产物。（3）免疫印迹检测Blotting原理与ELISA相同。待测蛋白硝酸纤维素膜一抗二抗辣根过氧化物酶底物产物，并发出光PAGE胶待测蛋白底片曝光辣根过氧化物酶：HRP1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与膜上的蛋白结合。2）洗去未结合的一抗。3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRP）。4）清洗掉未结合的二抗。5）用HRP的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，冲洗胶片。Blotting过程④结果多克隆抗体Blotting的结果单抗blotting结果3）质谱法思考题1、大肠杆菌转化的原理及过程？2、克隆子鉴定包括哪些方法？