疫苗佐剂的现状和未来

疫苗佐剂的现状和未来发展趋势当今使用的单纯重组和人工合成抗原制成的疫苗存在一些不足，这些抗原的免疫原性远不及传统活疫苗或灭活疫苗。因此，这类疫苗的使用就需要功能强大的疫苗佐剂的辅助。毫无疑问，目前在世界范围内大部分国家铝佐剂依然是唯一可用于人的疫苗佐剂。虽然铝佐剂能诱导产生体液免疫反应，但是对细胞免疫的刺激几乎不起任何作用，而细胞免疫对许多病原体的免疫保护至关重要。另外，铝佐剂引起剧烈的局部和全身性副作用，能引起肉芽肿、嗜伊红血球过多和肌筋膜炎，但是这些剧烈副作用很少发生。也有人担心铝佐剂能引起诸如老年痴呆症之类的神经退化性疾病。因此，当前急需安全、高效，适合人类使用的疫苗佐剂，特别是能激发细胞免疫的安全无毒佐剂。鉴于当前的新型疫苗技术，需要适合黏膜递呈类疫苗、DNA疫苗、癌症和自身免疫类疫苗的佐剂。这些领域中，每一种疫苗的发展都与之相应的佐剂技术密切相关。本文回顾了疫苗佐剂的当前现状，探求未来的发展方向，最后提出人类疫苗佐剂发展和审批的障碍和阻力。关键词：佐剂，免疫反应，黏膜免疫，疫苗佐剂起源免疫接种的目的是诱发机体产生对接种抗原强大的免疫反应，以保护机体免受相应病原体的侵袭。为了达到此目的，和减毒疫苗相比，灭活疫苗需要佐剂的协助。佐剂是一类能增强针对一同接种的抗原特异性免疫反应的物质。“佐剂”一词来源于拉丁语“adjuvare”，是协助和增强之意。佐剂概念最早起源于二十世纪二十年代，Ramon等人发现接种白喉类毒素疫苗部位形成脓肿的马产生更高的特异性抗体。随后他们发现，脓肿的形成能增强机体对类毒素的免疫反应，脓肿则是接种时引入与白喉类毒素不相关的物质引起。1926年Glenny等人通过吸附于铝佐剂的白喉类毒素证明了铝佐剂的佐剂活性。至今，铝盐类复合物（主要是磷酸铝和氢氧化铝胶）依然是人用疫苗的只主要佐剂。1936年，Freund开发出含有分枝杆菌的水和矿物油乳剂，从而研制出目前所知佐剂中效力最最强的佐剂——弗氏完全佐剂。尽管复试弗氏完全佐剂作为佐剂的黄金标准，但是此种佐剂能引起剧烈的局部反应，不能作为人用疫苗佐剂。不含分分枝杆菌的水包油乳佐剂成为弗氏不完全佐剂毒性较轻，已经用于人用疫苗。20世纪50年代Johnson等人发现革兰氏阴性菌的脂多糖具有免疫增强剂的功能，去除毒性的脂多糖或者相关复合物（如脂质A）已经用于人用疫苗佐剂的研究。1974年，Lederer等人发现弗氏完全佐剂佐剂中的分枝杆菌胞壁酰二肽具有佐剂活性。细菌成分虽然一般具有毒性作用，但通常也是很强的免疫激活剂。例如，细菌DNA中具有免疫激活作用的CpG序列是最强的细胞免疫激活剂之一。具有免疫激活作用的CpG是细菌DNA中一类去甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸，而不存在于哺乳动物的DNA中。总之，数百种天然或人工合成复合物都已经发现具有佐剂的作用。很多佐剂的免疫增强作用远远强于铝佐剂，但由于其毒性是其很难成为人用疫苗佐剂。佐剂的作用使用佐剂有不同目的：（1）增强超纯或重组抗原的免疫原性；(2)减少抗原的使用量或免疫接种的次数；（3）提高疫苗对新生儿，老年人或免疫缺陷者的效果；（4）提高抗原递呈系统通过黏膜对抗原的摄取。佐剂的选择选择合适的佐剂是应该考虑到抗原种类，欲免疫动物的种类，免疫接种的途径以及可能引起的副作用。理想的佐剂应该有较长的保质期，机体能够进行生物降解，价格便宜。同时不会引起自身免疫反应，并且能够激发预期的免疫反应（如根据免疫保护的需求诱发体液或者细胞免疫反应）。不同的免疫途径会使佐剂产生明显不同的效果（例如黏膜和注射途径）。因此，新型载体，抗原递呈系统和佐剂复合物应该考虑到计划免疫途径的特性。佐剂的安全性佐剂与抗原混合使用的优势必须与其存在的副作用达到平衡。佐剂引起的副作用何意分为局部性和全身性的。重要的局部反应主要有疼痛，局部炎症，肿胀，注射部位坏死，发热，佐剂性关节炎，葡萄膜炎嗜伊红细胞增多，变态反应，过敏性反应，器官特异性毒性以及免疫毒性（例如细胞因子的释放，免疫抑制或自身免疫病）。可惜的是，很强的佐剂活性通常都与强的毒性相伴随。例如，弗氏完全佐剂具有很强的免疫增强作用，但由于其毒性使其不能作为人用疫苗佐剂。因此，佐剂研制中最大的难题之一就是获得很强免疫作用的同时减少副作用。尽管铝佐剂已经发现80多年了，但依然是当今人用疫苗的主要佐剂，通过这些我们可以看出克服佐剂研制中难题的艰难程度。佐剂规程要求对人用疫苗佐剂的要求要远远高于兽用疫苗佐剂。不仅需要对佐剂本身进行预期临床试验，而且在一期临床试验开始之前还要对抗原佐剂复合物进行毒性研究。毒性学的评估主要通过诸如小鼠，兔子之类的小动物进行，免疫途径和计划使用的人用途径相同。前期临床毒性试验的免疫剂量和免疫接种次数应该高于或像似与人计划用剂量，以便放大佐剂存在的安全性问题。预期临床试验研究同时也可以优化出最佳的疫苗免疫剂量。佐剂的分类可以依据佐剂的来源，作用机制，以及理化特性对其进行分类。Edelman把佐剂分为三种类型：（1）免疫激活剂，主要指增强抗原的免疫原性的物质；（2）运载类佐剂，对T细胞起协助作用的蛋白；（3）载体类佐剂，油乳剂或脂质体不仅可以最为抗原的基质，而且也能刺激免疫反应。第二种是根据免疫接种途径把佐剂分为黏膜类佐剂和注射用类佐剂。第三种分类方法把佐剂分为铝盐类和其他矿物盐类佐剂，细菌衍生物佐剂，载体和缓释佐剂，细胞因子。最近提出的第四种分类方法把佐剂分为如下种类：胶状佐剂，微生物衍生物，油乳剂，微粒类佐剂，融合蛋白或脂质短肽类佐剂。佐剂的局限性尽管在佐剂的作用机制研究方面已经取得进展，但是铝佐剂依然是人用疫苗的主要佐剂。多年以来虽然提议很多种佐剂，但是由于毒性，稳定性，生物可利用性以及成本使其不能成为人用疫苗佐剂。由于粒子大小，电荷，疏水性都可以影响蛋白与佐剂的结合，因此很难根据经验确定何种佐剂与特定的蛋白或肽段结合能产生最佳的效果。此外，在佐剂疫苗制剂制备过程中，抗原表位可能发生变化。如果使用蛋白载体类佐剂，机体预先存在的针对载体蛋白的免疫会是其使用受到限制。而且，每种佐剂都形成特有的免疫反应。例如，铝盐类佐剂疫苗不能诱导产生Th1抗体类型或细胞免疫反应，以及不能对多糖类抗原起到协助作用，从而限制了其在多种疫苗中的应用。主要佐剂种类矿物盐类佐剂铝盐类佐剂自Glenny等人的实验以来，铝盐，尤其是磷酸铝和氢氧化铝是应用最广的人用疫苗佐剂。不足之处在于，铝盐类佐剂免疫增强作用相对较弱，并且不能诱导产生细胞免疫反应。研究显示，铝盐类佐剂通过在接种部位形成抗原库使抗原缓慢释放，从而发挥免疫佐剂的功能。铝胶对可溶性抗原的吸附作用可以延长抗原与免疫系统的作用时间。其他作用机制涉及到补体，嗜酸性细胞，巨噬细胞，激活和增加抗原递呈细胞对10微米以下微粒的吞噬效率。机体对铝胶佐剂疫苗耐受性比较好，当进行皮下和皮内免疫接种时发生肉芽肿的几率大于肌肉注射。铝胶佐剂其他方面的不足在于能增加IgE，变应原性和神经毒性。正常情况下，低剂量的铝可以通过肾脏排泄，但是在肾脏功能衰退等一些特殊情况下，铝就会在体内积聚，具有很大的毒性。机体内高剂量的铝首先影响大脑和骨组织，引起严重的神经综合征和透析性痴呆症。铝毒性还与肌萎缩性脊髓侧索硬化症和老年痴呆症有关。其他矿物盐类佐剂钙盐，铁盐和锆盐也作为抗原吸附剂，只是没有铝盐的使用范围广。尤其是磷酸钙已经作为白喉—破伤风—百日咳疫苗佐剂。虽然与铝盐具有相似的性质，但是磷酸钙佐剂也具有以下优点：钙是人体的天然结构成分，机体对其有很高的耐受性。磷酸钙对抗原具有很好的吸附作用，能诱导高水平的IgG，不会增加IgE的量。磷酸钙百日咳疫苗神经性反应也很少见。Tensoactive佐剂QuilA是来源于皂皮树科树皮的一种水提取物，对于需要很强的细胞免疫反应的疫苗来说，通过反向定向色谱层析从QuilA中纯化得到的成分，主要是指QS-21，有望成为铝佐剂大代用品。皂苷是一种糖苷，由多糖或寡聚糖与非极性的糖苷配基三萜结构连成。皂苷对T细胞依赖性抗原以及T细胞非依赖性抗原具有很强的免疫辅助作用。皂苷也能诱导很强的细胞毒性CD+淋巴细胞，同时也能增强对黏膜抗原的免疫反应。QuilA已经成功地用于兽医领域，QuilA由23中不同的皂苷组成，对人类毒性太大限制了使用。QuilA不仅引起严重的局部反应和肉芽肿，而且还能造成溶血，说明皂苷对红细胞表面的胆固醇具有亲和力，致使细胞膜溶解和溶血。从QuilA中提取的QS-21与QuilA相比毒性较弱，但也存在以上相同的缺点，不适合人类的使用，对一些诸如HIV感染的威胁生命的疾病则可以使用。微生物衍生物佐剂由于微生物衍生物具有很强的免疫刺激作用，所以微生物衍生物成为佐剂主要的潜在来源。细胞壁肽聚糖或革兰氏阴性细菌的脂多糖能增强机体对一同接种的免疫原性差的抗原产生免疫反应。这类佐剂是通过激活Toll样受体而发挥作用的，Toll样受体介导能激活宿主免疫防御系统的危险信号。作为佐剂来源的微生物种类主要有分枝杆菌，棒状杆菌，百日咳博代氏杆菌，脑膜炎双球菌。不足之处在于，全微生物活的或灭活的全菌体通常因为毒性太大而不能作为人用佐剂。N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D异谷酰胺，也称其为MDP。MDP的免疫佐剂活性取决于免疫接种的条件。在盐溶液中主要增强体液免疫，但与脂质体或者甘油混合使用时能诱导很强的细胞免疫。MDP激活多种不同的细胞，包括，巨噬细胞，白细胞，肥大细胞和纤维原细胞。而纤维原细胞诱导诸如IL-1细胞因子，B细胞生长因子和成纤维细胞激活因子的分泌。MDP也能诱导过氧化物，前列腺素和胶原酶的分泌。从MDP中分离的不同化合物包括苏氨酰-MDP，是一种很强的无热源疫苗佐剂。来源于革兰氏阴性菌的其他重要化合物是脂多糖，这种物质是很强的B细胞分裂原，也能激活T细胞产生IFN-γ和TNF，因此增强细胞免疫反应。脂多糖中免疫佐剂活性以及毒性作用取决于其结构成分脂质A。在弱酸性的条件下脂质A水解为单磷酰脂A，单磷酰脂A能保持脂质A的免疫佐剂活性同时减小其毒性。另外一种来源于细菌细胞壁具有佐剂活性的是海藻糖二霉菌酸酯（TDM），能诱导很强的体液免疫和细胞免疫反应。结核分枝杆菌DNA具有佐剂活性的证实进一步发现细菌核酸上高含量的CpG基序与佐剂活性有关。含有CpG基序的DNA具有很强的刺激细胞免疫的功能。油佐剂这类佐剂包括水包油和油包水佐剂，如弗氏不完全佐剂，Montanide，佐剂65和Lipovant。油乳剂作用机制为在接种部位形成抗原“储存库”，减缓抗原的释放速度，同时刺激浆细胞产生抗体。通常，油乳剂毒性太大不适用于人的免疫接种。但是可用于终端治疗，例如癌症，因为此时机体的耐受性很强。油乳剂常见的副反应主要包括注射部位的炎性反应，肉芽肿和溃疡。为了找到稳定，功能强，并且毒性小的佐剂类型，不同类型的天然油已经用于研究。佐剂65在体内能被代谢排出，当用于IFA中时效果优于矿物油佐剂。诸如油包水或水包油包水之类的佐剂也用于IFA中，并且更稳定，黏度更小更易于接种，很少会形成肉芽肿。Montanide属于油基质类佐剂家族，与天然抗原，重组和人工合成抗原制成的实验用疫苗已经用于小鼠，兔子，猫和狗的实验。Montanide也已经用于抗HIV，疟疾和乳腺癌的人用试验疫苗中。脂质体佐剂脂质体是有脂质层组成的复合球状结构，能把抗原囊括在脂质体内，发挥疫苗递呈载体和佐剂的双重功效。脂质体的功效却决于脂质层的层数，电荷，成份和制备方法。此种佐剂能增强蛋白和多糖类抗原的细胞免疫和体液免疫效应，同时也能延长血液中抗原的半衰期，从而确保有疫苗中有更多的抗原能与抗原递呈细胞接触。脂质体佐剂的稳定性，制备工艺，以及质量问题一直是此种佐剂成为人用疫苗佐剂的主要影响因素。聚合微球体佐剂在微粒和聚合体家族中，聚乙烯微球体已经被广泛的用于研究。这是一种不引起机体排斥反应，可在体内降解，并且能与不同的抗原配合使用的微球体。此种佐剂的优点之一在于，可以通过改变微球体不同成分的浓度人为控制微球体的降解速度，从而可以控制抗原的释放速度。细胞因子佐剂细胞因子属于现在分类佐剂之中。IFN-γ是多效细胞因子