铜、铁表面组装磷酸酯类缓蚀功能分子膜实验技术的研究

山东大学博士学位论文铜、铁表面组装磷酸酯类缓蚀功能分子膜实验技术的研究姓名：郭文娟申请学位级别：博士专业：物理化学指导教师：陈慎豪20070416铜、铁表面组装磷酸酯类缓蚀功能分子膜实验技术的研究作者：郭文娟学位授予单位：山东大学相似文献(3条)1.学位论文王天德锆离子改善缓蚀剂自组装修饰膜的结构及性能研究2008不锈钢设备发生腐蚀会给国民经济造成巨大的损失。多年来，寻找合适的防腐技术一直是电化学工作者义不容辞的责任。其中，围绕新型缓蚀剂的开发及其应用已有大量的研究报道。本文采用在生物电化学和生物传感器制备中已有应用的分子自组装(Self-assembled)技术，在不锈钢电极表面修饰用作缓蚀剂的有机磷酸酯，利用极化曲线，交流阻抗谱，循环伏安等测量了不锈钢电极组装前后在3％(bymass)NaCl溶液中的腐蚀速率和缓蚀速率，与接触角测试结果进行了讨论。利用烷基磷酸能与金属锆(Zr4+)离子和金属氧化物发生配位作用，分别组装了单层膜和双层膜修饰的不锈钢电极。结果表明不锈钢表面修饰单层有机磷酸酯其抗腐性能得一定的增强。已有报道证明，烷基磷酸能与金属锆(Zr4+)离子和金属氧化物可发生配位作用，因而，本文选择了十烷基磷酸钠和Hexamethylenediamine-N,N,N',N'-tetrakis(methylphosphonicacid)作缓蚀剂，应用自组装方法组装了单层膜修饰的电极不锈钢和以Zr4+离子作交联剂修饰制得了双层膜修饰的不锈钢电极。缓蚀剂自组装膜修饰电极的缓蚀效率与缓蚀剂的表面覆盖度有关，接触角测试是有效的考察方法之一。接触角和交流阻抗谱等测试结果表明，利用锆离子可以在不锈钢表面自组装行成双层有机磷酸酯膜。同时，有机磷酸酯作缓蚀剂在不锈钢表面电极自组装单、双层膜的极化曲线测量结果表明，单层膜修饰电极较之裸不锈钢的腐蚀电位正移，有一定的缓蚀效果，但双层膜修饰的不锈钢腐蚀电位有更多的正移，腐蚀电流也进一步降低，表明抗腐蚀效果更佳。实验证明，本研究工作提出的用锆离子作交联剂来改善缓蚀剂自组装膜的结构，从而提高材料的抗腐蚀性能的方法是可行而有效的，为提高缓蚀效率和开拓缓蚀剂更广泛的应用提供了一种新的思路，为缓蚀剂作用机制的研究提供一定的参考价值。2.学位论文陈兆鹏信号增强电化学免疫分析法研究2007本文在增强免疫分析信号尤其是电化学免疫分析信号方面做了以下工作：1．提出了一种基于直接吸附蛋白质于多孔纳米金膜表面的免疫传感器。在这种方法中，我们通过在-0.5V(vs.Ag/AgCl)电解0.08M氯金酸和0.004M乙酸铅的混合溶液在玻碳电极表面得到一层多孔纳米金膜，并将羊抗人IgG抗体吸附于纳米金膜表面，在夹心免疫反应完成后，利用辣根过氧化物酶催化底物生成不溶物并吸附于电极表面，由于不溶物的吸附，使得电子转移阻抗大大增加。这种放大了的阻抗信号与人IgG的浓度在0.011～11ng/ml范围内成线性关系，检测限为0.009ng/ml。2．提出了一种基于生物催化金属沉积结合阳极溶出伏安检测的电化学放大免疫分析法。在这种方法中，抗体首先通过一层自组装膜而被固定于金电极表面。夹心免疫反应后，碱性磷酸酯酶标记的抗体被捕捉于电极表面。碱性磷酸酯酶催化抗坏血酸磷酸酯水解成抗坏血酸，生成的抗坏血酸将银离子还原并沉积在蛋白质修饰过的电极表面。然后通过电化学法将银氧化溶出并用阳极溶出伏安法来检测溶出的银离子。和用直接伏安法检测催化生成抗坏血酸相比，用阳极溶出伏安法检测金属离子更为灵敏。因为沉积的银与酶催化生成的抗坏血酸的量有关，而抗坏血酸的量又取决于连接在电极上的酶的量，所以溶出峰电流的大小与目标抗原的量相关。这种结合了酶的催化放大作用和阳极溶出伏安法检测金属离子的高灵敏度的免疫分析法显著地提高了分析的灵敏度。3．提出了一种基于双电极转换系统作为信号放大装置的电化学免疫分析法。这种装置由两个用盐桥连接起来的电解池，一个免疫电极，一个检测电极以及连结于它们之间的导线组成。吸附有抗体的免疫电极在发生夹心免疫反应后，被作为阳极置于酶反应液中，另外一支检测电极置于银沉积液，免疫电极表面的碱性磷酸酶催化磷酸抗坏血酸酯水解生成抗坏血酸，生成的抗坏血酸通过这种装置被在阴极区的银离子氧化，使得单质银被沉积于检测电极表面，经过30分钟的酶催化反应，大量的金属银便沉积于电极表面。由于酶的催化产物是在产生的同时，就被银离子氧化，基本上不会因催化产物扩散到溶液中而使分析信号受到损失。通过阳极溶出法直接检测电极表面的沉积银的量，可以大大提高分析的灵敏度，同在同一支电极上的化学沉积法相比，这种将酶催化反应和金属沉积过程分在两个不同的电解池中的电化学法避免了因金属沉积于蛋白质表面对酶的活性的影响。4．提出了一种基于辣根过氧化物酶(HRP)对银沉积的抑制作用的新型电化学信号放大免疫分析法。在这种方法中，抗体首先通过一层自组装膜而固定在金电极上，经过夹心免疫反应后，使HRP酶也结合在电极表面。当有过氧化氢(H,2O,2)存在时，HRP酶抑制了对苯二酚还原银离子在电极表面沉积为单质银的过程。我们采用了线性扫描伏安法检测电极表面沉积的银的量，结果表明银的溶出峰电流与人免疫球蛋白IgG的浓度在50-2500ng/mL范围内成线性关系，检测下限为35ng/mL。5．提出了一种基于生物催化沉积金属纳米粒子并结合金属纳米粒子继续催化金属沉积使它本身增大的信号连续放大电化学免疫分析法。我们先将羊抗人抗体吸附于聚苯乙烯微孔板上，在免疫反应及催化沉积完成后，将微孔板内的金属溶解，采用溶出伏安法测定溶解的金属离子。由于这种方法结合了酶的催化作用及金属纳米粒子的催化作用进行连续放大，分析的灵敏度得到了显著地提高。溶出峰电流与人IgG的浓度在0.1～10ng/ml范围内成线性关系。显然，这种这种利用了酶的高催化活性及纳米粒子催化作用的方法在提高免疫分析的灵敏度方面有着广阔的应用前景。6．提出了一种以纳米金作为电化学标记物的免疫传感器。在这种方法中，抗体首先通过被动吸附而固定于碳糊电极的表面，接着定量结合抗原和纳米金标记的抗体以形成免疫夹心复合物。为了检测结合在电极表面的纳米金的量，先以电化学法氧化纳米金生成AuCl,4'-离子，然后采用吸附伏安法定量检测吸附在电极表面的AuCl,4'-离子。峰电流与抗原(人IgG)浓度在10到500ng/ml范围内成线性关系，其检测下限为4.0ng/ml。7．除了对信号增强电化学免疫分析法本身的研究之外，我们运用电化学及其它手段研究提出了一种新型、简便、灵敏的荧光免疫分析方法。这种方法基于夹心异相免疫分析，并利用了纳米颗粒标记的抗体可以产生荧光淬灭的特性。羊抗人IgG首先吸附在微孔板上，接着人IgG被羊抗人IgG捕捉结合，再被纳米金标记的抗体夹心形成免疫复合物。然后加入氢氧化钠和柠檬酸三钠的混合溶液解离免疫复合物，获得的含有纳米金标记抗体的溶液用于进行荧光淬灭分析。在517nm处激发的荧光素的荧光强度与人IgG的浓度成反对数线性关系，其检测范围是10到5000ng/mL，检测下限是4.7ng/mL。同时我们也用电化学实验和可见紫外检测分别验证了纳米金标记的抗体是否解离完全以及解离后是否团聚。这个方法可以延伸扩展至检测其他目标分子如DNA链和其他抗原，而且在临床诊断上有着广阔的应用前景。3.学位论文黄勇电化学基因分型及免疫分析方法的研究2008蛋白质和核酸是生命体中最重要的两类生物大分子，核酸碱基的突变是诱导许多遗传病的原因，而各种蛋白质在人体内含量的变化直接反映了人体新陈代谢情况，已成为疾病诊断的主要依据。因此，对蛋白质和核酸的检测分析在生命科学研究和疾病的临床诊断领域具有十分重要的意义。并且，建立高灵敏的蛋白质和核酸分析方法，一直以来都是分析科学家们的研究重点之一。电化学检测技术由于有灵敏度高、所需仪器简单、检测成本低、易于实现微型化等优点，使得以电化学检测为基础的生物分析技术具有极其广阔的应用前景。因此，在本研究论文中，我们发展了几种电化学基因分型技术以及蛋白质检测方法：(1)建立了一种基于缺口-连接反应原理以及表面杂交技术的电化学基因分型方法，提出了均相酶介导等位区分与表面杂交检测的分析结构，解决了电化学界面核酸酶反应效率与忠实性的困难，并实现了β-地中海贫血基因中-28位点SNP的检测。在该方法中，我们设计了一对与目标检测链互补的引物探针与目标DNA杂交后，形成了一个在突变位点处有一个单碱基缺口的杂交体，该杂交体在有与突变点碱基配对的碱基存在下，能在聚合酶和连接酶的作用下发生缺口填充和连接，使两条分离的引物探针连接起来。当连接产物与目标DNA解离后，利用在两条引物探针中预先设计好的两段互补的碱基序列之间发生分子内杂交而形成具有茎．环的发夹状二级结构。该发夹结构产物能被固定在金电极表面的捕获探针捕获到电极表面，这样，在引物探针中的电活性标记物二茂铁被吸附到电极表面且能极大程度地靠近电极表面，从而产生氧化-还原电流，达到高灵敏、高选择性基因分型的目的。(2)发展了一种基于等位特异性延伸的电化学SNP基因分型方法。该方法通过硫辛酸修饰寡核苷酸探针在金电极表面的自组装来构建传感器界面。在当引物与模板DNA完全匹配时，在聚合酶作用下发生等位特异性延伸反应，产生二茂铁标记型产物，当延伸产物在与目标链解离后，在溶液中能发生分子内杂交而形成发夹结构。从而使该产物能特异性地与电极上的捕获探针杂交。在电化学检测过程中，在电极上可以检测出二茂铁的特征还原峰，且峰电流大小与目标链浓度对数成线性关系。而当引物末端碱基与模板DNA上的不匹配时，等位特异性延伸反应不能进行，捕获探针与电活性探针在设定的反应温度下无法进行杂交，因而在电化学检测中，电极上检测不出二茂铁的还原峰。从而实现对SNP的检测。并且使用该方法成功地实现了对β-地中海贫血基因的-28位点SNP基因分型的检测。(3)制备了一个以多克隆抗体作为捕获探针，并以一个由血小板衍生化生长因子—BB(platelet—derivedgrowthfactorBB，PDGF—BB)适体启动的、嵌入有亚甲基兰电活性物质的环形长链DNA作为检测探针的高灵敏的电化学免疫传感器，并利用该传感器实现了对PDGF—BB的定量检测。首先，PDGF抗体通过交联剂和金电极表面的单层巯基丙酸自组装膜发生共价交联而被固定到电极表面。当有目标分析物PDGF—BB存在时，固定到电极表面的抗体能特异性地识别PDGF—BB并与之结合，从而将目标分析物捕获到电极表面。与此同时，我们将一个在5’端含有PDGF适体的引物在聚合酶的作用下沿着一个单链环形质粒DNA模板分子延伸，形成了一个在5’端含有PDGF适体的环形双链DNA检测探针，并在环形DNA的双链结构中嵌入电活性物质亚甲基兰。而环形检测探针的适体部分能够和被捕获到电极上的PDGF—BB发生特异性结合而将环形检测探针捕获到电极表面，从而可以使大量的电活性物质亚甲基兰在电极表面发生富集，产生较强的氧化还原电流。根据产生的电流的大小可实现对PDGF—BB的定量检测。PDGF—BB浓度在50pgmL-1～500ngmL-1范围内，传感器的响应电流与PDGF—BB浓度有很好的线性相关性。(4)建立了一种以微间距插指电极阵列(MGIDEA)为基础电极，结合酶的生物催化银沉积反应来放大分析信号的高灵敏检测前列腺特异性抗原(prostatespecifieantigen，PSA)的电学式免疫传感器。该传感器采用传统的夹心酶联免疫反应模式来完成免疫反应：PSA140单克隆抗体作为捕获抗体通过和微间距插指电极表面的硅烷化层发生共价交联被固定到微间隙里面。当有目标分析物PSA和碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)标记PSA103单克隆抗体存在的情况下，在电极表面和捕获抗体一起通过特异性免疫反应形成一个捕获抗体PSA140/目标分析物PSA/检测抗体PSA103—ALP的夹心复合物。而吸附到电极表面的ALP能够催化其底物抗坏血酸磷酸酯(AAP)水解并生成相应的还原剂抗坏血酸