PCR产物纯化

PCR产物的直接纯化一．原理PCR产物一般都含有过量的引物、TaqDNA酶及dNTP，这些成分的存在将直接影响到后续的酶切、双脱氧PCR测序反应等过程，因此有必要除去。目前核酸纯化的方法有很多，商用化试剂盒的出现使得DNA的纯化过程变得更加简便快捷。本实验中，BufferPCR-A促使大于100bp的DNA片断选择性地吸附到silica膜上。经BufferW1、BufferW2洗涤去除残留在silica膜上的小于50-mer的引物、酶蛋白、单核苷酸、荧光染料或放射性同位素标记的单核苷酸后，吸附到silica膜上的DNA片断经微量水或Eluent洗脱下来，即可用于各种分子生物学的操作。二．材料与方法1材料PCR产物2仪器、用具恒温孵育器（65℃）、离心机、移液器、1.5ml离心管3试剂BufferPCR-A；BufferW1；已加无水乙醇的BufferW2；Eluent或去离子水4方法(1)在PCR反应液中加入3倍体积的BufferPCR-A，若需加入的BufferPCR-A不足100μl，则加入100μl。(2)将DNA-prepTube置于2-mlMicrofugeTube中，将步骤⑴中的混合液移入DNA-prepTube中，5500rpm离心1min。(3)弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，加入500μlBufferW1，5500rpm离心1min。(4)弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，加入700μl已加无水乙醇的BufferW2，5500rpm离心1min，以同样的方法再用700μl已加无水乙醇的BufferW2洗涤一次。(5)弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，14000rpm离心1min。(6)连滤液一并弃掉收集管，将DNA-prepTube置于一新的1.5ml离心管中，在silica膜中央加入25-30μlEluent或去离子水（65℃预热）。(7)室温静置2min，14000rpm离心1min洗脱DNA。(8)取5μl样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。