正式答辩-1

胃癌、癌旁和正常组织端粒长度的变化研究生刘继昌导师张宪法河北大学基础医学院前言材料与方法结果结论致谢讨论前言端粒长度与肿瘤?端粒长度与胃癌?前言本课题旨在检测胃癌、癌旁和正常胃黏膜组织平均端粒长度的变化，并探讨胃癌平均端粒长度变化与临床病理指标的关系，为阐明胃癌发生、发展的机制提供一定的理论依据。前言材料和方法实验材料。材料和方法标本主要试剂主要仪器标本取自郑州大学第一附属医院，河南省肿瘤医院，河南省人民医院新鲜胃癌手术标本，32例。经病理检测高中分化6例，低分化19例，黏液细胞癌和印戒细胞癌7例。材料和方法主要试剂DNA探针标记和检测试剂盒Ⅱ（博士德公司产品）硝酸纤维素膜（Amersham公司）尼龙膜（Osmonics公司产品）杂交液(Sangon公司产品)裸DNA探针5‘-(CCCTAA)3-3’（Sangon公司合成）BCIP/NBT（Promega公司产品）琼脂糖（BBI公司产品）λ-HindⅢdigestDNAMarker（TaKaRa生物公司产品）HinfⅠ酶（TaKaRa公司产品）其他一般试剂均购自进口及国产分析纯级试剂材料和方法主要仪器水平电泳槽DYY－Ill型（北京六一仪器厂）BP121S型分析天平（德国Sartorious公司）紫外光分光光度计U－2001型（HITACHI）生物洁净工作台BCM-1000（苏州安泰空气技术公司）GeneGenius凝胶成像分析系统（Syngene公司）杂交仪（ROBBINS）台式离心机(HERAEUS)超低温冰箱（Forma公司）材料和方法实验流程提取基因组DNA检测DNA的浓度和纯度Southern印迹杂交转膜免疫检测加入制备好的探针5‘-(CCCTAA)3-3’图象扫描分析HinfⅠ酶消化基因DNA凝胶电泳杂交材料和方法探针制备随机引物法标记探针检测探针灵敏度探索探针最适工作浓度DNA斑点杂交法材料和方法探针随机引物标记（1）用灭菌去离子蒸馏水稀释1ug裸探针DNA至总体积16ul。（2）DNA热变性。（3）加4ulDIGRandomLabelingMix(高效)，混匀后再离心2000/r.p.m×5分钟。（4）置37˚c水浴槽内24h。（5）加入2ul10mMEDTA以终止反应，置-20˚c保存备用。材料和方法探针灵敏度检测（1）将模板DNA稀释成1000pg／μl，100pg／μl，10pg／μl，1pg／μl，100℃，15min，迅速移至－20˚c冰乙醇中。（2）将NCM（硝酸纤维素膜）用20×SSC浸透后凉干。（3）取1μl各稀释度样本点至各圆形NCM中心，80℃，2h。（4）预杂交：将烘干的NCM放入多孔加样板的孔洞中，每孔加入20μl预杂交液，封孔后，42℃，3h。（5）杂交：吸出预杂交液，加入1μl标记DNA混合于100μl杂交液的液体20μl，封孔后，42℃，24h。材料和方法（6）用冲洗液洗膜2次，并吸弃。（7）封闭液封闭，室温，1h。（8）加入封闭液稀释的Anti－Dig－AP（l：2500），37℃，1h。（9）冲洗液冲洗3×15min，室温。（10）显色缓冲液平衡2min，室温。（11）加入显色缓冲液稀释的BCIP／NBT（1：50），室温，避光显色，数分后，信号出现。（12）加入TE液中止反应。材料和方法探针灵敏度检测Southern印迹杂交1.凝胶电泳上样量：已酶切后的DNA3ug。1×TBE电泳缓冲液，恒压60V，电泳2～4h。2.转膜变性、中和处理Southern转印DNA固定3.杂交（1）将尼龙膜漂浮于一盘2×SSC的液面上，待其由下至上完全湿润，将膜侵入液体内泡2分钟。（2）湿润尼龙膜放入杂交袋中，灌注预杂交液，封口机封口，42℃预杂交4－12个小时。（3）按100cm2膜加入3.5ml杂交液的量将适量探针加入杂交液中，浓度为100ng/ml。材料和方法Southern印迹杂交（4）42℃，杂交16－20个小时。（5）杂交结束后，倒出杂交液，用洗膜Ⅰ液洗，2分钟×3次。（6）倒出洗膜1液，换加洗膜Ⅱ液于58℃水浴中洗膜两次，5分钟×2次。（7）杂交膜在冲洗液中平衡1min。（8）按100ml/100cm2的量于封闭液中室温缓慢摇动1小时。（9）按20ml/100cm2膜的比例用封闭液1：2500稀释Anti-Dig-Ap加入稀释的抗体混合物，37℃反应1个小时。（10）倒掉抗体液，将膜取出，放入玻璃盘内，按100ml/100cm2的量用冲洗液洗膜，室温下15min×2次。4.免疫显色材料和方法平均端粒长度的计算材料和方法LogX=LogMS+(LogML-LogMs)(Ds-Dx)/(Ds-DL)X:平均末端限制片断长度Ms：小分子量标记ML：大分子量标记Ds：小分子量标记迁移距离DL：大分子量标记迁移距离统计软件为SPSS10.0检验水准为0.05材料和方法统计学分析结果一.杂交前标本制备结果基因组DNA凝胶电泳鉴定结果结果M123232.0Kb图1胃黏膜组织基因组DNA的凝胶电泳M：DNA分子量标记1-3：胃黏膜组织基因组DNA9.46.64.42.3基因组DNA酶切电泳结果结果图2胃黏膜组织基因组DNA酶切电泳结果M：DNA分子量标记1-6：酶切后胃黏膜组织基因组DNAM1234569.44.4236.62.32.0Kb图3胃黏膜组织基因组DNA酶切电泳结果M：DNA分子量标记1、3：胃黏膜组织基因组DNA2、4：酶切后胃黏膜组织基因组DNAM1234239.46.64.42.32.0Kb二.探针制备结果探针灵敏度检测结果结果地高辛标记的DNA探针灵敏度达1pg／μl，未加模板DNA者为阴性。图4探针灵敏度检测结果1000pg100pg10pg1pg无模板DNA探针最适工作浓度的检测结果25ng/ml的探针浓度杂交信号强度和背景显色适中。结果图5探针最适工作浓度检测结果200ng/ml100ng/ml50ng/ml25ng/ml12.5ng/ml6.25ng/ml三.Southern印迹杂交结果图5胃癌、癌旁和正常胃黏膜的Southern印迹检测结果M：DigMolecularweightmarker1、4：正常组织2、5：癌旁组织3、6：胃癌组织239.46.64.42.32.0KbM123456239.46.64.42.32.0KbM123图6胃癌、癌旁和正常胃黏膜的Southern印迹检测结果M：DigMolecularweightmarker1：正常组织2：癌旁组织3：胃癌组织光密度扫描结果结果图7光密度扫描结果图11光密度扫描结果四.统计分析结果P值P＜0．05P＞0.05P＞0.05年龄组20-2930-3940-4950-5960-6937104810.767±0.2527.471±0.2146.780±0.2356.275±0.4574.725±0.6569.533±0.6436.900±0.2525.980±0.3085.650±0.3113.936±0.9408.476±0.5036.229±0.2635.010±0.5384.825±0.6243.050±1.149正常癌旁癌组织TRF（Kb，X±S）例数不同年龄组患者正常、癌旁和癌组织的平均TRF检测结果结果结果3.54.55.56.57.58.59.510.20~29岁30~39岁40~49岁50~59岁60~69岁图8正常胃黏膜组织中端粒长度与患者年龄的关系端粒长度（Kb）年龄（岁）706050403020端粒长度（kb）12108642图9正常胃黏膜组织中端粒长度与患者年龄的线性回归关系注：回归系数r=－0.120,P＜0．05结果组织类型胃癌组织癌旁组织正常胃黏膜组织TRF（Kb，X±S）5.088±1.7125.969±1.6596.728±1.707胃癌、癌旁和正常胃粘膜组织的平均端粒长度注：三组间两两比较P＜0.05012345678胃癌癌旁正常胃黏膜端粒长度（Kb）图10胃癌、癌旁和正常胃粘膜组织的平均端粒长度组织学分级高中分化低分化黏液腺癌或印戒细胞癌例数TRF（Kb，X±S）61975.567±0.95.068±1.7954.729±2.102组织学分级不同的胃癌标本TRF检测结果结果注：三组间两两比较P＞0.05浸润深度黏膜层和黏膜下层深肌层浆膜层例数TRF（Kb，X±S）311185.900±0.6565.082±1.4904.956±1.963不同浸润深度的胃癌标本TRF检测结果结果注：三组间两两比较P＞0.05淋巴结转移有无例数TRF（Kb，X±S）19134.811±1.7325.492±1.666有无淋巴结转移的胃癌标本TRF检测结果结果注：两组间比较P＞0.05临床病理参数*性别男性女性#肿瘤大小（直径）＜3cm≥3cm例数TRF（Kb，X±S）122013195.108±1.5695.075±1.8325.054±1.4135.111±1.927不同性别和肿瘤大小胃癌标本TRF检测结果结果注：两者组间比较P*＞0.05，P#＞0.05讨论一.端粒长度的测定讨论1.染色体末端限制性片段分析(TRF)染色体原位杂交Southernblot2.在TRF长度扫描时发现有些癌和癌旁组织扫描图显示出双峰.考虑其中一个与邻近正常组织波峰接近的可能是正常组织污染造成的.二.端粒长度与供体年龄1.端粒长度与细胞衰老。2.端粒长度与供体年龄的关系，目前尚有争议。讨论本研究检测认为，正常胃黏膜端粒长度与供体年龄明显负相关，但在胃癌和癌旁组织里，端粒长度的变化与供体年龄无显著相关性。讨论三.端粒长度与临床肿瘤1.端粒长度与肿瘤发生pRb+p53mortalSenescenceAndcrisisimmortalM1M2讨论2.端粒长度在肿瘤组织中的改变(1)端粒长度在肿瘤组织中的改变看法不一相应正常组织TRF的改变肿瘤类型结肠癌肝癌食管癌皮肤基底细胞癌肾细胞癌讨论本实验检测的结果表明按正常胃黏膜-癌旁-胃癌组织的顺序,端粒长度明显缩短。本实验中还发现有三例胃癌标本端粒长度缩短不明显甚至延长。(2)本研究结果讨论3.端粒长度与肿瘤的临床病理指标(1)端粒长度与肿瘤临床病理指标的关系不明确(2)本实验结果表明胃癌组织的平均端粒长度与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移等病理指标无显著相关性。正常胃黏膜组织端粒长度与供体年龄负相关。按正常胃黏膜-癌旁-胃癌的顺序端粒长度明显缩短。胃癌端粒长度缩短与临床病理指标无显著相关性。结论衷心感谢导师张钦宪教授在学习上对我的悉心指导和谆谆教诲以及在生活上无微不至的关心。衷心感谢吴景兰教授、丁一副教授和姜国忠博士在实验过程中给予的热心指导和帮助。衷心感谢组胚教研室全体老师给予的热心帮助和支持。衷心感谢河南省分子医学重点实验室范清堂老师,张胜利老师等的热心帮助。致谢衷心感谢王萍、李克虹、宋文洁、王颖芳、魏海燕等同学的无私帮助。衷心感谢研究生处各位老师的热情指导和帮助。衷心感谢我的家人在学习和生活上对我无微不至的关怀。衷心感谢所有帮助和关心我的人。端粒Telomericrepeats(5’-TTAGGG-3)Shortsatellite-likerepeatsMiddlerepetitiveelementsTelomereTelomere-AssociatedSequences讨论239.46.64.42.32.0KbM123239.46.64.42.32.0KbM123456