复习DNA重组技术的基本工具

一、基因工程的概念理解1.供体：提供__________2.操作环境：______3.操作水平：__________4.原理：__________5.受体：表达目的基因6.本质：性状在______体内表达7.优点：克服_______________障碍，定向改造生物_____目的基因体外分子水平基因重组受体远缘杂交不亲和性状一、基因工程诞生的理论基础1．基因拼接的理论基础(1)DNA是生物的主要遗传物质。(2)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。(3)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。化学本质相同，都是DNA；基因与质粒的结构相同2．外源基因在受体内表达的理论基础(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。(2)遗传信息的传递都遵循中心法则阐述的信息流动方向。(3)生物界共用一套遗传密码。胰岛素基因重组后能在细菌细胞内表达，还说明所有生物共用一套遗传密码二、DNA重组技术的基本工具1.限制性核酸内切酶（简称：限制酶）（1）来源：主要从______生物中分离纯化出来。议一议：限制酶主要存在于原核生物中，它有什么意义？答案：限制酶在原核生物中主要是切割外源DNA，使之失效，从而达到保护自己的目的。原核（2）作用：识别特定的___________并切开相应两个核苷酸之间的_____________。核苷酸序列磷酸二酯键（3）结果：产生__________或平末端。黏性末端2.DNA连接酶（1）种类：按来源可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。（2）作用：在两个核苷酸之间形成____________以连接______________。两段DNA片段磷酸二酯键①E·coliDNA连接酶来源：大肠杆菌作用特点：只连接黏性末端②T4DNA连接酶来源：T4噬菌体作用特点：连接黏性末端和平末端3.载体（1）种类：_____、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。能__________有一个至多个________________有特殊的__________【点拨】提取目的基因和切割载体使用同一种限制酶，目的是能形成相同的黏性末端，形成重组DNA分子。质粒自我复制限制酶切割位点标记基因2）质粒特点(3)作用：①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。(4)一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。基因工程的工具1.与DNA相关的酶（1）五种DNA相关酶的比较：作用底物作用部位形成产物限制酶DNA连接酶DNA聚合酶DNA解旋酶DNA分子磷酸二酯键黏性末端或平末端DNA片段磷酸二酯键重组DNA分子脱氧核苷酸磷酸二酯键子代DNADNA分子DNA分子碱基对间的氢键磷酸二酯键形成脱氧核苷酸单链游离的脱氧核苷酸DNA(水解)酶（2）限制酶和DNA连接酶之间的关系图示：2.作为载体的条件条件适应性稳定并能复制目的基因稳定存在且数量可扩大有一个至多个限制酶切割位点可携带多个或多种外源基因具有特殊的标记基因便于重组DNA的鉴定和选择【高考警示钟】1.切割质粒需使用限制酶1次，切割目的基因则需要使用相同的限制酶2次。因为质粒是环状DNA，而目的基因在DNA分子链上。2.质粒DNA分子上限制酶切割位点的选择必须保证至少有一个标记基因是完整的，如果标记基因全部被切开则不便于鉴定与选择。3.基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同，基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。【典例训练1】我国科学家成功克隆了控制水稻理想株型的关键多效基因IPA1。研究发现，基因IPA1发生突变后，会使水稻穗粒数和千粒重（以克表示的一千粒种子的重量）增加，同时茎秆变得粗壮，增加了抗倒伏能力。实验显示，将突变后的IPA1基因导入常规水稻品种，可以使其产量增加10％以上。下图表示该水稻新品种的简易培育流程，据图回答：（1）上图所示流程中步骤①是实验所用技术的核心步骤。此步骤使_____________和_________构成________________，常用的工具酶是________。。突变的IPA1基因Ti质粒重组DNA限制性核酸内切酶、DNA连接酶（2）若要在体外扩增IPA1基因可采用PCR技术。标准的PCR过程分为三个步骤，第一步是“变性”即解旋，这一步骤如果发生在细胞内，是在__________的作用下完成的（3）从变异类型上分析，该水稻的新性状应该属于可遗传变异中的__________。（4）④过程应用的主要生物技术是_______________。DNA解旋酶基因重组植物组织培养【解析】图中①为基因表达载体的构建，把目的基因和载体用同种限制性核酸内切酶切割，在DNA连接酶的作用下，构成重组质粒；PCR过程中第一步的变性就是“解旋”，在体外是通过加热使DNA解旋，在细胞内则是在DNA解旋酶的作用下完成的；基因突变发生于重组前，重组细胞中组合的是突变后的IPA1基因与水稻DNA；④过程为胚细胞发育成植株的过程，应用的技术为植物组织培养技术。答案：（1）（重组质粒）（2）（3）（4）【解题指南】1.知识储备熟悉DNA重组技术操作过程需要的工具，包括相关的酶和载体，及相关酶的作用特点。2.解题思路（1）首先明确目的基因与载体形成重组质粒的过程需用的酶及该过程的原理；（2）明确由胚细胞发育成完整植株所用的生物技术。三、基因工程的基本操作程序1.目的基因的获取（1）目的基因：编码蛋白质的______。从_________中获取（2）获取方法利用_________扩增目的基因通过__________用化学方法直接人工合成基因基因文库PCR技术DNA合成仪2.基因表达载体的构建——基因工程的核心（1）由图可知载体的组成：_________、启动子、终止子、__________。（2）构建目的：①使________在_________中稳定存在，并且可以遗传给下一代；②使________能够表达和发挥作用。目的基因标记基因目的基因目的基因受体细胞3.将目的基因导入受体细胞（1）转化:目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持___________的过程。（2）常用方法：导入植物细胞:_____________、基因枪法、花粉管通道法导入动物细胞:_____________导入微生物细胞:感受态细胞法（或Ca2+处理法）稳定和表达农杆菌转化法显微注射技术4.目的基因的检测与鉴定（1）_________________→目的基因的有无（2）分子杂交技术→________________（3）_______________→目的基因是否翻译（4）生物性状的表达与否→目的基因是否表达（个体水平）【点拨】启动子、终止子与起始密码子、终止密码子不同：启动子、终止子在DNA上,在遗传信息转录时起调控作用；而起始密码子、终止密码子在mRNA上,在翻译时起作用,决定翻译的开始和结束。分子水平DNA分子杂交技术目的基因是否转录抗原—抗体杂交基因工程的基本操作程序1.目的基因的获取（1）从基因文库中获取目的基因：如从基因组文库或cDNA文库中获取。（2）利用PCR技术扩增目的基因：利用DNA复制的原理在体外特异性的复制某DNA片段以获得呈指数方式增加的目的基因。（3）人工合成法：通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。2.基因表达载体的构建（1）基因表达载体组成：①启动子、终止子:是基因转录的起点和终点，在转录过程中起调控作用。②标记基因:作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来,如抗生素抗性基因。③目的基因：能控制特定性状的外源基因。（2）基因表达载体的构建步骤：载体(质粒)同一种限制酶切割带有黏性末端切口带有相同黏性末端的目的基因片段重组DNA(环状重组质粒)DNA连接酶DNA分子(含目的基因)3.将目的基因导入受体细胞生物种类植物动物微生物常用方法受体细胞转化过程农杆菌转化法显微注射技术感受态细胞法体细胞受精卵原核细胞将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子4.目的基因的检测与鉴定【高考警示钟】1.目的基因的插入位点不是随意的基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。2.基因工程操作过程中第三步没有碱基互补配对现象第一步存在逆转录法获得DNA，第二步存在黏性末端连接现象，第四步检测存在分子水平杂交方法。【典例训练2】（2011·山东高考改编）人类疾病的转基因动物模型常用于致病机理的探讨及治疗药物的筛选。利用正常大鼠制备遗传性高血压转基因模型大鼠的流程如图所示。（1）图中的高血压相关基因作为________，质粒作为_______，二者需用__________切割后连接成重组载体，该过程与质粒上含有__________有关。（2）重组DNA导入的受体细胞是大鼠的__________细胞，常用的方法是_________。在DNA重组过程中核心的操作是________。（3）子代大鼠如果__________和__________，即可分别在分子水平和个体水平上说明高血压相关基因已成功表达，然后可用其建立高血压转基因动物模型。（4）在上述转基因大鼠的培育过程中，所用到的主要胚胎工程技术是体外受精、早期胚胎培养和__________。【解题指南】1.考查实质本题主要考查基因工程的操作程序，涉及到胚胎工程技术。2.解题关键高血压相关基因与质粒形成重组DNA后导入到受精卵细胞中，是DNA重组技术。【解析】（1）根据题干中“利用正常大鼠制备遗传性高血压转基因模型大鼠”推出，目的基因为与高血压相关的基因。为使目的基因与载体结合需用同一种限制性核酸内切酶切割。（2）重组DNA分子导入受体细胞中，植物细胞、动物细胞和微生物细胞导入目的基因的方式不同，动物细胞主要用显微注射技术将重组DNA分子导入细胞中。基因工程操作的第二步，即基因表达载体的构建是整个过程中的关键。（3）如果检测到相应蛋白质，即可在分子水平说明目的基因已经表达，如果检测子代大鼠已患高血压，即可在个体水平说明目的基因已经表达。(4)在上述转基因大鼠的培育过程中，所用到的主要胚胎工程技术是体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植。早期胚胎需要移植入体内，以提供一个稳定的环境和充足的营养供应。答案：（1）目的基因载体同一种限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的切割位点（2）受精卵显微注射技术基因表达载体的构建（3）检测到相应蛋白质已患高血压（4）胚胎移植1.（2012·福州模拟）浙江大学农学院喻景权教授的课题组最新研究发现，一种植物激素——油菜素内酯能促进农药在植物体内的降解和代谢。研究人员发现，用油菜素内酯处理后，许多参与农药降解的基因(如P450和GsT)的表达和酶活性都得到提高，在这些基因的“指导”下合成的蛋白酶能把农药逐渐转化为水溶性物质或低毒无毒物质，有的则被直接排出体外。某课题组进一步进行了如下的实验操作，请回答：（1）获得油菜素内酯基因的方法有_____________（举二项即可）。第①步用PCR技术扩增基因时用到的耐高温的酶通常是指_____________。步骤②用到的酶有_____________。（2）图中导入重组质粒的方法是______________。在导入之前应用______________处理。（3）导入重组质粒以后，往往还需要进行检测和筛选，可用______________制成探针，检测是否导入了重组基因；在培养基中加入______________可将含有目的基因的细胞筛选出来。（4）请你为该课题命名______________。（5）请你说说该研究发现的生态学意义：__________________________________