植物高光效育种

植物高光效育种光合作用是决定作物产量最重要的因素之一，作物中90％以上的干重直接来源于光合作用。因此，光合作用效率的高低直接关系到作物的产量。根据光合作用碳同化途经中CO2固定的最初光合产物的不同，可把高等植物分成C3、C4和景天酸植物。C4植物是从C3植物进化而来的一种高光效种类。与C3植物相比，它具有在高光强、高温及低CO2浓度下保持高光效的能力。而一些主要农作物如水稻、小麦、马铃薯、甜菜等均为C3作物。通过提高农作物的光合作用效率来提高产量水平，即高光效育种，一直是国际光合作用研究和作物育种等领域专家关注的热点。自20世纪60年代以来，人们一直试图利用C4光合特性来改进C3植物的光合效率。传统的杂交育种手段至今尚未取得令人满意的结果，其杂种F1和F2代的光合效率均比任何一个亲本都低。随着生物技术的发展，为利用基因工程手段培育高光效作物提供了一条行之有效的途径。本文就近年来该方面的研究进展作一综述。1高光效基因工程育种的理论基础C3植物中，CO2的固定主要取决于1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(ribulose1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase,Rubisco)的活化状态,它催化1,5-二磷酸核酮糖(RuBP)羧化，将大气中的CO2同化，产生两分子磷酸甘油酸，可见Rubisco在C3植物中同化CO2的重要性。C4植物固定CO2的酶为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvatecarboxylase，PEPC),与C3作物中Rubisco相比，PEPC对CO2的亲和力高。C4植物的细胞分化为叶肉细胞和鞘细胞，而光合酶在两类细胞中的分布不同,如PEPC在叶肉细胞固定CO2，生成草酰乙酸(OAA),OAA进一步转化为苹果酸(Mal),Mal进入鞘细胞脱羧,被位于鞘细胞内的Rubisco羧化,重新进入卡尔文循环。这种CO2的浓缩机理导致了鞘细胞内高浓度的CO2积累，一方面提高Rubisco的羧化能力，另一方面又大大抑制了Rubisco的加氧活性,降低了光呼吸,从而使C4植物保持高的光合效率。正是因为C4途径具有高光合能力，以及C3植物中C4途径的客观存在，启示了通过基因工程将C4途径的关键酶编码基因导入C3植物的可能性，为利用基因工程手段培育高光效作物品种提供了理论依据。2高光效基因工程育种策略2.11,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的修饰与改造植物光合作用过程中最大的限制酶是Rubisco，它的反应速度每秒只有2～3次，与一般的酶促反应速度(每秒25000次左右)相比，效率极低；Rubisco是一个双功能酶，它不仅催化RuBP的羧化反应，而且还催化其加氧反应。加氧反应中除消耗能量外，还损失羧化反应中固定的20％～50％的有机碳。为提高作物中Rubisco同化CO2的效率，许多研究者希望通过改变酶的结构来改变其羧化/加氧的比值，从而提高作物的光合效率，但至今仍未获得成功。自从Read和Tabita(1994)发现在硅藻和红藻中存在的Rubisco具有比高等植物高得多的效率后，Uemura等又发现了一种嗜热红藻的Rubisco羧化效率约是高等植物的2.5～3倍。更高效率的Rubisco在红藻中的发现，给修饰改造Rubisco的长期努力提供了新的动力和希望。Whitney等通过质体转化的方法将红藻高效率Rubisco的小亚基编码基因引入烟草的叶绿体中得到了高效表达，但是表达的小亚基却不能与烟草本身的大亚基组装成全酶。酶的组装是一个十分复杂的过程，还有待于进行深入研究。2.2C3光合途径关键酶基因的克隆与转化C4光合途径主要涉及3种关键酶，即磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、磷酸丙酮酸二激酶(pyruvateorthophosphatedikinase，PPDK)和依赖于NAD(P)的苹果酸酶[NAD(P)-dependentmalicenzyme，NAD(P)-ME]。目前，C4途径的3种关键酶基因均已从不同的C4植物中克隆出来并分别导入不同的C3植物中。C4型PEPC基因的cDNA是首先从玉米和黄花菊属植物Flaveriatrinervia中克隆出来的(Izui等，1986；Poetseh等1991)。玉米C4型PEPC基因全长约6.8kb，结构基因由10个外显子和9个内含子组成；其cDNA长度为2.91kb，编码970个氨基酸残基，其蛋白质分子量为109.4kDa。玉米PPDK基因全长约12kb，有19个外显子，其中第一外显子编码转运肽，第一内含子由于包含细胞质型PPDK的启动子，长达5.9kb；其mRNA编码947个氨基酸残基，前体蛋白质分子量为102.7kDa，其中N端71个氨基酸残基是转运肽，成熟蛋白包含876个残基。玉米NADP-ME的cDNA全长2184bp，编码636个氨基酸残基，前体蛋白分子量为69.8kDa。Hudspeth等将玉米PEPC的cDNA与烟草Cab(chlorophyllla/bbindingprotein，编码光系统I和光系统II的捕光叶绿素结合蛋白的基因家族)基因的启动子和终止子重组在一起并转到烟草中，转基因植株PEPC的活性比对照高2倍。Gehlin等将由CaMV35S(cauliflowermosaicvirus35Sgene，烟草花叶病毒35S基因)启动子调控的Corynibacteriumglutanicum、E.coli和Flaveriatrinervia的PEPC基因导入马铃薯，获得了PEPC活性提高2～12倍的转基因植株。Ishimaru等将拟南芥RbcS(rubiscosmallsubunit，1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基基因)启动子和CaMV35S启动子调控的玉米PPDK基因导入拟南芥中，转基因植株的PPDK活性为对照的4倍。他们还将玉米的PPDK基因转入马铃薯中，转基因植株的PPDK活性比对照高5.4倍。Takeuehi等将CaMV35S启动子调控的玉米NADP-ME基因cDNA导入水稻，Tsuchida等将水稻Cab启动子调控的玉米NADP-ME基因cDNA导入水稻，虽然获得了酶活显著提高的转化苗，但在自然光下，转基因植株的叶片白化，生长受到明显抑制。将C4光合途径关键酶基因的cDNA转入C3作物中已有许多成功报道，但所获得的转基因植株的相关酶活远远低于C4植物，而全长基因的导入，显著提高了转基因植株的酶活。Ku等将玉米PEPC的全长基因(包括外显子、内含子及自身的启动子)用农杆菌介导法导入水稻，获得了高水平表达玉米PEPC的转基因植株；在一些转基因植株中，PEPC的活性甚至比玉米中的高2～3倍，达到叶片可溶性蛋白的12％。同对照相比，转基因植株显著减少了氧气对光合的抑制作用。继Lepiniec等(1992)从高粱中克隆出PEPC全长基因后，张方等从不同的高粱品种中克隆出一种新型的PEPC基因，并将之导人水稻中，获得了PEPC活性较对照高26倍的转基因植株。陈绪清等采用LA-PCR方法从玉米中克隆出全长PEPC基因，并将其导入小麦。通过对转基因小麦叶片中PEPC酶活性的初步测定，发现部分转基因植株叶片中PEPC酶活性提高了3～5倍，与玉米叶片中的PEPC酶活性相当。Fukayama等将玉米PPDK全长基因及不同启动子调控的cDNA分别导入水稻，结果表明，转全长基因的水稻PPDK活性比非转基因水稻高40倍，而转cDNA的水稻PPDK的活性仅为对照的5倍。3高光效基因工程育种进展中存在的问题C4关键酶基因向C3作物的成功导入及其在C3作物中高效表达，说明利用基因工程手段培育高光效作物品种的可行性，但仍有许多问题需要进行深入系统的研究。3.1PEPC基因的转化虽然许多转基因植株PEPC的酶活与未转基因植株相比显著提高，但光合效率并未提高。如Ku等得到的转基因水稻，其PEPC活力甚至是玉米的2～3倍，但是除了其抗氧抑制的能力有所增强外，并未发现光合效率有所提高。转基因植物中PEPC活力的提高，势必使其作用的产物——草酰乙酸(OAA)的浓度升高；如果生成的OAA不能迅速脱羧或被转运掉，其PEPC活力就会被OAA强烈抑制，因而就难以实质性地启动单细胞内的四碳双羧酸微循环而有效提高转基因作物中四碳双羧酸浓度，以致最终不能有效地提高光合效率。3.2脱羧酶基因的转化由于C3植物中PEPC基因的转入未能有效地提高转基因作物的光合效率，因此，人们又将C4循环中与脱羧相关的酶基因导人C3作物中，如磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenopyruvatecarboxykinase，PEPCK)和NADP-ME。由于PEPCK是细胞质型的酶，若将其转到细胞质中，其脱羧反应发生在细胞质中，因而使得四碳双羧酸仅在细胞质中进行无效循环，并不能提高叶绿体内的CO2浓度，从而也难以提高Rubisco的效率。因此，人们开始尝试把脱羧相关酶基因转到叶绿体中。Hausler等将来自于F.pringlei的NADP-ME或S.meliloti的PEPCK基因连同来自C.glutamicum的PEPC基因一同导人烟草中，结果对植物的光合表现并未产生实质性的影响。Lipka等报道，将PEPC基因和NADP-ME基因分别转入细胞质和叶绿体中，结果除了能在高光强、高温下对同化CO2的电子需求有所降低外，其光合作用效率依然没有改善。3.3叶绿体内磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的再生将PEPC和NADP-ME基因引入C3植物，都未能有效地改善C3植物光合作用，因而人们又将注意力放在转基因植物中叶绿体内PEP再生问题上。PPDK催化叶绿体内PEP的生成。Ku等报道，过量表达PEPC和PPDK的转基因水稻的光合能力和产量分别增加35％和22％，这种结果有可能是由于PPDK基因的导入增加了叶绿体中PEP的含量所致，当然，这只是一种猜想，还需进一步的试验证明。3.4叶绿体中PEP的输出将叶绿体中由PPDK或PEPCK催化形成的PEP有效地转运出去是在C3植物中运行C4循环的一个前提条件。C3植物中计绿体型的PEP转运器(phosphoenolpyruvate/phosphatetranslocator，PPT)仅有很低的活性，势必成为四碳双羧酸循环的一个限制因素。据Hiiusler等引自UIFliigge实验室未发表资料表明，来自花椰菜芽的PFF基因在CaMV35S启动子调控下导入烟草，转化体中PEP转运速度同野生型相比提高了10倍。但目前对PPT活性的调节因素、PPT基因的表达、调控方式以及它在植物代谢中的作用等了解得还远远不够。今后还需在转运器基因的克隆和功能分析上作更深入的研究，从而为提高植物光合效率提供新的思路。3.5碳酸酐酶(carbonicanhydrase，CA)CA在C4光合中是一种很关键的酶，它在光合作用的初始阶段，催化CO2到HCO-3的快速转化，而HCO-3是PEPC作用的底物。据李卫华等援引Hatch等(1990)的研究结果，CA有两种，即细胞质CA和叶绿体CA。C4植物体内的CA主要是细胞质CA，而C3植物的CA主要是叶绿体CA，这两种CA动力学性质及对CO2的亲和力和对抑制剂的敏感性相似。C3植物的CA存在于叶绿体中，所以当将C4植物的PEPC基因导入C3作物的同时，是否需要考虑将C4型的CA基因一同导入，目前还未见这方面的报道。3.6转化受体对C4循环酶代谢反应具有种间差别Hausler等的研究结果表明，即使是亲缘关系比较近的物种如马铃薯和烟草，对于C4循环中基因的过量表达反应也有很大差别。例如，过量表达PEPC的转基因烟草对于细胞质型NADP-ME的诱导与转PEPC马铃薯相比极不明显。而且，在表达PEPC/NADP-ME马铃薯的双转化体中，观察到了光呼吸减弱的现象，而该现象只在转单一PEPC基因的烟草中观察到。C4循环酶在C3作物中代谢的种间差异将会在一定程度上阻碍高光效基因工程育种的发展。3.7多基因转化C4循环系统是多种酶相互作用的复杂的生化反应途径。在高光效基因工程育种的初级阶段，大多研究集中于