酶的化学修饰

酶的化学修饰第一节酶的分子修饰一、酶的化学修饰原因1、稳定性2、酶反应的最适条件3、酶的专一性4、米式常数过大5、临床应用的特殊要求6、酶种类的限制改变酶特性有两种主要的方法：1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。二、酶分子修饰通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。三、酶分子修饰的意义提高酶的活力增强酶的稳定性降低或消除酶的抗原性研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响化学修饰效果举例用纤维蛋白的专一性单克隆抗体修饰尿激酶，使其溶血栓性提高了100倍。用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成亲水性的α－NHCH2COOH后，该酶对60℃热处理的稳定性增高了1000倍。超氧化物歧化酶(SOD)、L-谷氨酰胺酶、L-天门冬酰胺酶、尿酸酶等用PEG(聚乙二醇)修饰后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，减慢了它们在动物血液循环中被清除的速度，酶的活力可以保存15％-45％。四、酶化学修饰的基本原理1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：A大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。B酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。4、如何消除酶的抗原性酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除“遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合5、酶微环境稳定的维持pH值改变时：①破坏了酶分子上静电形成的化学键，氢键等维持天然构象的平衡力②改变了酶分子上氨基酸残基的离解状态和它们之间的相互结合及作用方式许多大分子修饰剂本身就是多聚电解质，能在酶分子表面或微环境区域形成一层“缓冲外壳”。第二节酶分子修饰的基本要求和条件一、修饰剂的要求1、修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附性2、修饰剂上反应基团的数目及位置3、修饰剂上反应基团的活化方法与条件一般要求较大分子量、良好的生物相容性和水溶性、分子表面有较多反应活性基团；试剂的选择—要根据修饰目的选择例如对氨基修饰可有几种情况——修饰所有氨基而不修饰其它基团；仅修饰α-氨基；修饰暴露的或反应性高的氨基；修饰具有催化活性的氨基；例：如果修饰目的是希望改变蛋白质的带电状态或溶解性，则必须选择能引入最大电荷量的试剂。用于修饰酶的氨基酸残基的试剂应具备：选择性地与一个氨基酸残基反应；反应在酶蛋白不变性条件下进行；所标记的残基在肽链中稳定以易于分离鉴定；修饰反应的程度能简单测定；二、酶性质的了解（1）酶的稳定性热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等（2）酶活性中心的状况活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等（3）酶侧链基团的性质及其反应性巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、酚基、胍基、吲哚基、二硫键、硫醚基等三、反应条件的选择修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。（1）pH与离子强度pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。（2）修饰反应的温度与时间严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。（3）反应体系中酶与修饰剂的比例四、酶蛋白修饰反应的主要类型1.酰基化反应试剂特点：O含有R-C-结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化可作用基团：氨基，巯基，醇羟基（Ser、Thr），酚羟基（Tyr）修饰剂：乙酰咪唑、二异丙基氟磷酸、酸酐磺酰氯、硫代酸氟乙酰乙酯等。2.烷基化反应试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团（如－NH2，-SH等）发生烷基化。可作用基团：氨基（Lys，Arg），巯基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。修饰剂：2，4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。3.氧化和还原反应试剂特点：具有氧化性或还原性氧化剂：H2O2，N-溴代琥珀酰亚胺可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基、咪唑基，酚基等还原剂：2-巯基乙醇、DTT等可被还原的侧链基团：二硫键4.芳香环取代反应试剂：卤（碘）化，硝化试剂5.溴化氰裂解反应BrCN裂解Met反应可在自发诱导重排条件下导致肽键断裂。第三节酶分子的修饰方法酶的表面修饰——化学固定化1.通过酶表面的酸性或碱性氨基酸残基将酶共价连接到惰性载体上，从而改变酶所处的环境，酶的性质也相应发生改变。例如：酶固定到电荷载体上，由于介质中的质子靠近载体，并与载体上的电荷发生作用，使酶的最适pH发生偏移。糖化酶固定到阴离子载体上，最适pH4.5升到6.5，与D-木糖异构酶的最适pH7.5靠近，可简化高果糖浆生产工艺。2.载体与底物带相同电荷，固定化后反应系统Km增加，反之，Km降低。3.增加酶分子构象稳定性。酶的表面修饰——小分子修饰作用利用特定的小分子修饰剂修饰酶表面的一些基团：-COO-、-NH3+、-SH、-OH等。α-胰蛋白酶表面的-NH3+→NH2COOH→60℃，热稳定性提高1000倍。酶分子的侧链基团修饰采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基等。催化活性/非催化活性基团的修饰对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力。经常被修饰的残基是：亲核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His亲电的Tyr、Trp对催化活性基团可以通过选择性修饰侧链成分来实现氨基酸的取代。研究热点-核酸类酶的修饰RNA酶的侧连基团：指组成RNA的核苷酸残基上的功能团。主要是核糖2’-位置上的羟基和嘌呤、嘧啶碱基上的氨基和羟基。氨基的化学修饰：来源：Lys,Arg,His,Gln修饰反应：酰基化与烷基化酰基化修饰剂:三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）烷基化修饰剂：2，4－二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸等羧基的化学修饰修饰羧基的反应专一性较差常用水溶性羰二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸，可定量测定酶分子中羧基的数目巯基的化学修饰来源：Cys饰反应:烷基化修饰剂：碘乙酸(IAA)碘乙酰胺(IAM)N-乙基马来酰亚胺（NEM）（常用的专一修饰巯基试剂）汞试剂：HgCl2、对氯汞苯甲酸(pCMB)和2-氯汞硝基苯酚等Ellman试剂：5，5’二硫-二-（2-硝基苯甲酸)是目前最常用的巯基修饰试剂，还可用来测定酶蛋白巯基含量胍基的化学修饰来源：Arg修饰反应：本质上是羰基对氨基酰基化修饰剂：丁二酮二羰基化合物1，2－环己二酮酚羟基的化学修饰来源：Tyr修饰反应：芳香环取代反应、酚羟基的修饰修饰剂：N-乙酰咪唑、碘、硝化试剂四硝基甲烷（TNM）可以高度专一地对酚羟基进行修饰咪唑基的化学修饰来源：His修饰反应:酰基化与烷基化酰基化修饰剂:焦碳酸二乙酯烷基化修饰剂：碘乙酸吲哚基的化学修饰来源：Trp修饰反应：氧化反应修饰剂：N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）2-羟基-5-硝基苄溴（HNBB）4-硝基苯硫氯二硫键的化学修饰还原：巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）解释修饰效果须十分小心，因为：①任何一种修饰剂不是绝对专一的。②有些修饰剂引起蛋白质构象变化——失活。③不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子内部的必需基团，不易被修饰。酶的表面修饰——大分子修饰（大分子结合修饰），是目前应用最广的酶分子修饰方法。1定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。2修饰剂：聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下与酶分子结合。非共价修饰使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。共价修饰用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍。大分子修饰(共价)的过程修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得有较好修饰效果的修饰酶。聚乙二醇及其修饰反应聚乙二醇的特点：①线性分子(HO-CH2-CH2-O-CH2)n-CH2-OH；②具有良好的生物相容性和水溶性；③在体内无毒性、无残留、无免疫原性；④末端活化后可与酶产生交联；⑤覆盖在酶分子表面形成疏松的亲水外壳，导致流体动力学发生改变。聚乙二醇作为修饰剂应注意的问题：①PEG分子量为750~5000的修饰效果较好，用甲氧基PEG效果更好；②修饰效果还与所用活化剂与酶的配比有关，PEG:E=15~50:1→40%活力保持。③应尽量选择对酶活性影响小的修饰方法。（酶的抗原性和活性随分子表面自由氨基的减少而降低，当50%以上的自由氨基被修饰以后，酶基本没有抗原性了）叠氮法将PEG的末端羟基转化为叠氮基，然后与酶反应。琥珀酸酐法用二溴代琥珀酸酐在温和碱性条件下将PEG活化，经减压浓缩得活化PEG，可与酶分子上氨基交联。三氯均嗪法PEG经三氯均嗪法活化后，用石油醚抽提或减压蒸馏，制得活化PEG。羰二亚胺法修饰酶分子上的羧基重氮法将PEG末端羟基转换成重氮基团，再在弱碱性条件下修饰酶分子中的酚基、咪唑基。糖类的修饰反应溴化氰法右旋糖苷经溴化氰活化后，在碱性条件下与酶的游离氨基共价连接，生成修饰酶。高碘酸氧化法高碘酸将右旋糖苷上邻双羟基氧化成醛基，醛基再与酶分子上的氨基结合而生成修饰酶。分子内交联增加酶分子表面交联键的数目。分子间交联用双功能或多功能试剂使不同的酶交联起来产生杂合酶。脂质体包埋脂质体是天然脂类或类固醇组成的微球体。酶分子可包埋在其内部。它可通过细胞的膜融合和内吞作用进入细胞内。反相胶团微囊化表面活性剂溶解在非极性有机溶剂中可自发的形成近于球形的反相胶团。胶团内部水的极性、黏度、酸碱性和亲水性不同于外部的水。酶分子的内部修饰一、非催化活性基团的修饰亲核残基：Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His亲电残基：T