单向双向免疫琼脂扩散

实验单向、双向免疫琼脂扩散沉淀反应可溶性抗原（如细菌外毒素、血清蛋白等）与相应抗体特异性结合后，在一定条件（适量电解质、适宜的pH值及温度）下，经过一定时间，在比例适宜处形成肉眼可见的沉淀现象。沉淀反应沉淀反应环状沉淀反应絮状沉淀反应琼脂扩散试验双向扩散单向扩散＋电泳技术火箭免疫电泳对流免疫电泳单向免疫琼脂扩散实验原理将适量的抗体均匀混入琼脂内制成琼脂板，打孔，在孔中加入一定量的待测抗原，抗原向四周呈辐射状扩散，与抗体相遇，在比例合适时形成白色沉淀环。实验原理此方法用已知的抗体测未知的抗原。由于抗体已与凝胶混合，不会再扩散，仅抗原从小孔向四周扩散，因此称为单向琼脂扩散试验。沉淀环直径的大小与抗原含量成正比，用标准抗原制成标准曲线，从标准曲线上，可以查出待检样品中抗原的含量。实验原理1.测定沉淀环直径2.在标准曲线上查找相应抗原浓度绘制标准曲线标准品抗原浓度测定不同病人抗原浓度测定实验方法（一）标准曲线的制备制作琼脂板所需要的1%盐水琼脂（4mL）。首先分装其1/2量的2%盐水琼脂，溶化后置56℃水浴中平衡温度备用。实验方法稀释抗体：用pH7.2的PBS稀释标准兔抗牛IgG血清抗体，使最终浓度为抗体效价的一倍，其分装量应与2%盐水琼脂量相等。制备琼脂板：将已稀释的标准兔抗牛IgG血清抗体于56℃水浴中预热半分钟，再倾注于已溶化并维持56℃的2%盐水琼脂中混匀，取4ml即刻倾注于玻片上，待凝固后即可。实验方法打孔：将琼脂板置于模板上，在同一直线上用打孔器打孔5个，孔距10mm。用PBS缓冲液稀释不同浓度的标准参考蛋白。（牛免疫球蛋白IgG，应根据制品说明进行稀释）加样：将已稀释的不同浓度的标准参考蛋白依次用微量加样器每孔加入10ul。（注意：每一稀释度均应更换塑料吸头）。实验方法将加样的琼脂板放湿盒中，置37℃温箱，24小时后观察结果。用尺子测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵座标，以标准参考蛋白量（单位/ml）为横座标，绘制成标准曲线。实验结果用尺子测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵座标，以标准参考蛋白量（单位/ml）为横座标，绘制成标准曲线。实验结果注意事项制备抗体琼脂板时，琼脂温度必须严格控制，温度太低琼脂会凝固，太高则会影响抗体的活性；加样孔内的琼脂应挑干净，切不可损坏孔的边缘，确保每孔的液面基本一致；加样量一定要精确，并且不能逸出孔外，否则结果不好观察；注意事项加样时，吸取每份标本均应更换塑料吸头；实际检测过程中，标准曲线必须与样品测定同时制备；孵育时间应控制在24~48h，时间太短可能产生不了沉淀线，时间太长会造成沉淀线的扩散。双向免疫琼脂扩散实验原理可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散，彼此相遇后形成一定类型的特异性沉淀线。实验原理沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间比例，而且与其分子大小及扩散速度相关。当抗原抗体存在多个系统时，可呈现多条沉淀线乃至交叉反应。依据沉淀线的形态、清晰度及位置可以了解抗原或者抗体的性质。双向琼脂扩散试验的应用检测未知抗原或抗体抗原性质分析抗体效价滴定抗原或抗体纯度鉴定检测未知抗原或抗体A:浓度Ag、Ab及扩散率近似；B：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＞Ab；C：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＜Ab；D：浓度Ag＞Ab，扩散率近似；E：浓度Ag＞Ab，扩散率Ag＞Ab；F：浓度Ag＜Ab，扩散率Ag＜Ab；AgAbABCDEF抗原性质分析(1)沉淀线吻合：待检抗原与标准抗原完全相同。(2)沉淀线相切：待检抗原中含有与标准抗原相同的抗原，还含有另外的抗原与抗血清相对应。实验方法(3)沉淀线相交：待检抗原有与抗血清对应的抗原，但和标准抗原不同。(4)沉淀线部分吻合：待测抗原和标准抗原性质相同，但含量较低。抗体效价滴定周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为该抗体的效价。可进行任意稀释。抗原抗体纯度鉴定“1”为单一抗原抗体系统。“n”为多个抗原抗体系统。*可以用混合抗原鉴定抗体纯度。*可以用混合抗体鉴定抗原纯度。实验方法制作琼脂板所需要的1%盐水琼脂（4mL），溶化后置56℃水浴中平衡温度备用。将载玻片置于水平桌面上，倾注已融化1%盐水琼脂，制作琼脂板。琼脂凝固后，用打孔器打孔，本实验采用梅花型。实验方法加样：于中央孔加入牛IgG，周围1-5孔加入倍比稀释不同浓度的标准兔抗牛IgG血清抗体，6孔加入生理盐水作对照。每孔各加10μl。将琼脂板平放于湿盒内，置37℃温箱中，分别于24小时观察结果。实验结果观察孔间沉淀线的数目及特征。本试验1至5孔与中央孔之间是否可出现清晰的乳白色沉淀线。沉淀线与中央孔的距离随抗原的浓度减小而增大。6孔是生理盐水，为阴性对照，与中间空间无白色沉淀线。拍照记录，根据实验现象判断实验结果。实验报告根据实验结果，绘制标准蛋白曲线。绘制两个实验结果图。谢谢观看