第十章蛋白质和氨基酸的测定

第十章蛋白质和氨基酸的测定42蛋白质的定性测定1概述氨基酸的定性测定45氨基酸定量测定3蛋白质的定量测定—凯氏定氮法主要内容氨基酸的分离测定61、蛋白质的测定原理、测定方法、注意事项。2、氨基酸的测定原理、测定方法、注意事项。3、乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定原理1、蛋白质的性质和测定意义；2、凯氏定氮法测定蛋白质的原理和方法摘要；3、熟悉凯氏定氮仪的工作原理和使用方法。2.重点1、凯氏定氮法中蛋白质原理和关键环节。2、乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定原理。3.难点3.1.基本知识点学习目标第一节概述一、蛋白质的组成蛋白质是复杂的含氮有机化合物，它由20多种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，并具有复杂的空间结构。它主要含的元素是C、H、O、N、S、P另外还有一些微量元素Fe、Zn、I、Cu、Mn。而含N是蛋白质区别于其他有机化合物的重要标志。二、氨基酸pro是由氨基酸组成的高分子化合物，目前各种氨基酸已达175种以上，但是构成pro的氨基酸主要有20种。赖氨酸丙氨酸谷氨酸甘氨酸天冬氨酸缬氨酸天冬酰胺丝氨酸Pro的基本组成单位是氨基酸那什么是氨基酸呢？几种常见的氨基酸几种常见的氨基酸这些氨基酸结构上有什么共同点？羧基和氨基连接在同一个碳原子上蛋白质的基石物质：α-氨基酸氨基酸的缩合肽键二肽、多肽等1.误食重金属盐，可以喝大量牛奶进行紧急处理，WHY?2.鸡蛋水煮会发生什么样变化？3.医用酒精可以消毒，福尔马林可以保存动物标本，WHY？问：蛋白质具有什么样的性质呢？三、蛋白质的性质1.盐析2.变性小结蛋白质的主要组成元素？天然蛋白质的分子量：天然高分子有机化合物，分子量几万到几十万；哪些物质中富含蛋白质呢？Pro是食品的重要组成成分，也是生命的基础。人体11%-13%的总热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类型不同。测定食品中的蛋白质含量，对合理调配膳食，保证不同人群的营养需求，掌握食品的营养价值，合理开发利用食品资源，控制食品加工中食品的品质、质量都具有重要的意义。Pro是食品的最重要质量指标。食品营养价值的高低，主要看蛋白质的高低。四、蛋白质测定的意义除了保证食品的营养价值外，在决定食品的色、香、味及结构等特征上也起着重要的作用。蛋白质是微生物发酵中所必需的重要氮源之一。Eg.发酵原料中蛋白质含量的高低对发酵产品的质量影响很大。啤酒生产要选用蛋白质含量较低的大麦等原料，因啤酒酿造中，原料（大麦芽）中蛋白质含量过高，可造成啤酒浑浊、高级醇含量偏高。但对酱和酱油等发酵调味品来讲，则需要选用蛋白质含量较高的原料；至于活性干酵母，含氮量则是评价其成品质量的一个重要指标，主要是判定活性酵母菌的数量。四、蛋白质测定的意义五、蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法分两大类：一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。具体测定方法：凯氏定氮法：最常用的，国内外应用普遍。双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法国外：红外分析仪氨基酸总量—酸碱滴定法测定；各种氨基酸的分离与定量—色谱技术。有多种氨基酸分析仪。第二节蛋白质的定性测定（p116)一、蛋白质的一般显色反应电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并变色。（5种染料）二、复合蛋白质的显色反应（一）糖蛋白的显色（3种方法）（二）脂蛋白的显色（2种方法）第三节蛋白质的定量测定①总蛋白质含量；②氨基酸组成；③混合物中的特定蛋白质的含量；④蛋白质分离纯化过程中的蛋白质含量；⑤非蛋白氮；⑥蛋白质的营养价值(消化率、蛋白质功效比或氮平衡)蛋白质分析的重要性一、含量及测定意义食品种类蛋白质的百分含量食品种类蛋白质的百分含量大米(糙米)大米(白米)小麦粉(整粒)玉米粉(整粒)意大利面条玉米淀粉7.97.113.76.912.80.3大豆(成熟、生）豆(腰子状、生)豆腐(生、坚硬)豆腐(生、普通)36.523.615.88.1食品中蛋白质的含量乳制品牛乳(全脂，液体)牛乳(脱脂、干)切达干酪酸奶(普通的、低脂)水果和蔬菜苹果(生、带皮)芦笋(生)草莓(生)莴苣(冰、生)土豆(整粒、肉和皮)3.336.224.95.30.22.30.61.02.1肉、家禽、鱼牛肉(颈肉、烤前腿)牛肉(腌制、干牛肉)鸡(可供煎炸的鸡胸肉)火腿(切片、普通的)鸡蛋(生、全蛋)鱼(太平洋鳕鱼)鱼(金枪鱼、白色、罐装、油浸、滴干的固体)18.529.123.117.612.517.926.5食品中蛋白质的含量测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。二、蛋白质系数不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质含氮量为16%，即一份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、青豆、鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。一般手册上列出了一部分换称等数，用时可查。三、蛋白质含量测定常用的方法1.凯氏定氮法由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。凯氏定氮法是目前普遍采用的测定有机N总量较为准确、方便的方法之一，适用于所有食品，所以国内外应用较为广泛。是经典的分析方法之一，也是GB/T5009.5-2019《食品中蛋白质的测定》第一法。三、蛋白质含量测定常用的方法凯氏定氮法是将蛋白质消化，测定其总N量，再换算成为蛋白质含量。食品中的含N物质，除蛋白质中的氮以外，还包括氨基酸、酰胺、核酸等中的氮等少量的非蛋白质含N物质，所以该法测定的蛋白质含量应称为粗蛋白质。对于不同的蛋白质，它的组成和结构不同，但从分析数据可以得到近似的pro的元素组成百分比。元素CHONSP百分比50723160～30～3（一）、凯氏定氮法凯氏定氮法有常量法、微量法及改良法，其原理基本相同，只是所使用的样品数量和仪器不同。而改良的常量法主要是催化剂的种类、硫酸和盐类添加量不同，一般采用硫酸铜、二氧化钛或硒、汞等物质代替硫酸铜。有些样品中含有难以分解的含N化合物，如：蛋白质中含有色氨酸、赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、脯氨酸等，单纯以硫酸铜作催化剂，18小时或更长时间也难以分解，单独用汞化合物，在短时间内即可，但它有毒性。凯氏定氮法常量分析（macroanalysis）：对0.1g以上的试样进行的分析。半微量分析（semimicroanalysis）：对10mg～100mg的试样进行的分析。GB/T5413.1-2019婴幼儿配方食品和乳粉蛋白质的测定就是半微量凯氏定氮法微量分析（microanalysis）：对1mg1～10mg的试样进行的分析。超微量分析（ultramicroanalysis）：对1mg以下的试样进行的分析。痕量分析（traceanalysis）：对待测组分的质量分数小于0.01%的分析。超痕量分析（ultratraceanalysis）：对待测组分的质量分数小于0.0001%的分析。GB/T14666-2019分析化学术语（1）常量凯氏定氮法①原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再用标准酸滴定，根据标准酸消耗量可计算出样品中蛋白质含量。a)凯氏烧瓶500mL或250mLb)龙科A—凯氏定氮仪c)扭力天平d)分析天平e)5mL移液管f)温度可以控制的电炉g)小漏斗h)滴定管i)250mL锥形瓶j)玻璃珠②仪器（GB/T5009.5-2019《食品中蛋白质的测定》第一法）②仪器a)硫酸铜(CuSO4·5H2O)b)硫酸钾c)硫酸(密度为1.8419g/L)d)硼酸溶液(20g/L)e)氢氧化钠溶液(400g/L)f)盐酸标准滴定溶液[c(HCl)=0.0500mol/L]或硫酸标准滴定溶液[c(1/2H2SO4)=0.0500mol/L]g)混合指示液：1份甲基红乙醇溶液(1g/L)与5份溴甲酚绿乙醇溶液(1g/L)，临用时混合。(也可用2份甲基红乙醇溶液(1g/L)与1份次甲基蓝乙醇溶液(1g/L)临用时混合)。③试剂（GB/T5009.5-2019《食品中蛋白质的测定》第一法）（GB/T601-2019化学试剂标准滴定溶液的制备1、配制按下表的规定量取盐酸，注入1000mL水中，摇匀。常用酸碱浓度表(市售商品)（GB/T5009.1-2019食品卫生检验方法理化部分总则）盐酸标准滴定溶液的浓度[c(HCl)]mol/L盐酸的体积V/mL1900.5450.19试剂名称分子量含量/(%)(质量分数)相对密度浓度/(mol/L)盐酸36.536～381.18(约)12(HCl)硝酸63.0265～681.416(HNO3)高氯酸100.5701.6712(HClO4)磷酸98.0851.7015(H3PO4)硫酸98.196～981.84(约)18(H2SO4)盐酸标准滴定溶液配制与标定[c(HCl)=0.0500mol/L]2、标定按下表的规定称取于270～300℃高温炉中灼烧至恒重的工作基准试剂无水碳酸钠，溶于50mL水中，加10滴溴甲酚绿-甲基红指示液，用配制好的盐酸溶液滴定至溶液由绿色变为暗红色，煮沸2min，冷却后继续滴定至溶液再呈暗红色。同时做空白试验。说明：称量工作基准试剂的质量的数值小于等于0.5g时，按精确至0.01mg称量;数值大于0.5g时，按精确至0.1mg称量。在标定和使用标准滴定溶液时，滴定速度一般应保持在6～8mL/min。盐酸标准滴定溶液的浓度[c(HCl)]mol/L工作基准试剂无水碳酸钠的质量m/g11.90.50.950.10.2制备标准滴定溶液的浓度值应在规定浓度值的±5%范围以内。标准滴定溶液的浓度小于等于0.02mol/L时，应于临用前将浓度高的标准滴定溶液用煮沸并冷却的水稀释，必要时重新标定。除另有规定外，标准滴定溶液在常温15～25℃下保存时间一般不超过两个月。当溶液出现浑浊、沉淀、颜色变化等现象时，应重新制备。贮存标准滴定溶液的容器，其材料不应与溶液起理化作用，壁厚最薄处不小于0.5mm。（GB/T601-2019化学试剂标准滴定溶液的制备）1、配制按下表的规定量取硫酸，缓缓往入1000mL水中，冷却，摇匀。2、标定按下表的规定称取于270～300℃高温炉中灼烧至恒重的工作基准试剂无水碳酸钠，溶于50mL水中，加10滴溴甲酚绿-甲基红指示液，用配制好的硫酸溶液滴定至溶液由绿色变为暗红色，煮沸2min，冷却后继续滴定至溶液再呈暗红色。同时做空白试验。硫酸标准滴定溶液的浓度[c(1/2H2SO4)]mol/L硫酸的体积V/mL1300.5150.13硫酸标准滴定溶液的浓度[c(1/2H2SO4)]/mol/L工作基准试剂无水碳酸钠的质量m/g11.90.50.950.10.2硫酸标准滴定溶液[c(1/2H2SO4)=0.0500mol/L]溴甲酚绿－甲基红指示液（GB/T5009.5-2019《食品中蛋白质的测定》第一法）（GB/T603-2019化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备）溶液I：称取0.1g溴甲酚绿，溶于乙醇(95%)，用乙醇(95%)稀释至100mL。溶液Ⅱ：称取0.2g甲基红，溶于乙醇(95%)，用乙醇(95%)稀释至100mL。取30mL溶液I、10mL溶液Ⅱ，混匀。凯氏定氮法④步骤总反应式：2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O（一定要用浓硫酸-98%）样品消化1加硫酸钾作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点340℃，加入硫酸钾之后可以提高至400℃以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。为缩短消化时间硫酸铜作为催化